雨生红球藻软胶囊安全性毒理学评价

王彦武 覃光球 何 励 彭 亮 高玉秋 王绍龙

广西壮族自治区疾病预防控制中心卫生毒理所，广西南宁 530028

雨生红球藻（haematococcus pluvialis）是目前已知自然界中虾青素（Astaxanthin）含量最丰富的生物[1]，可达干重的1.43%～3.51%[2]，被看作是天然虾青素的“浓缩品”。研究显示，虾青素具有抗氧化[3-4]、抗肿瘤[5-6]、抗辐射[7]、抗炎[8-9]、增强免疫力[10]、调节血糖[11]等作用，在食品、药品、化妆品等领域应用较广[12]。2010年10月，我国原卫生部批准雨生红球藻为新资源食品，随后市场上涌现出国产雨生红球藻的不同剂型保健产品。本实验对以雨生红球藻为主要成分的某品牌雨生红球藻软胶囊进行急性、遗传毒性和大鼠30 d喂养试验研究，旨在为雨生红球藻及其产品开发提供安全性毒理学评价试验依据。

1 材料与方法

1.1 受试物

北京某医药科技有限公司送检的雨生红球藻软胶囊，内容物为紫红色油状物，主要成分为雨生红球藻油。人口服推荐用量为每人（成人）每日1次，每次1粒，成人体重按60 kg计算，折合剂量为6.7 mg/（kg·BW）。

1.2 实验动物

广东省医学实验动物中心提供的SPF级健康昆明种小鼠120只及SPF级健康SD种大鼠80只，动物生产许可证号为SCXK（粤）2013-0002，实验动物质量合格证号为44007200014053（小鼠）、44007200015 232（大鼠）。动物在实验室屏障系统正常饲养3 d后使用，环境温度为22～25℃，相对湿度为55%～70%。动物试验伦理经广西疾病预防控制中心伦理审查委员会批准。

1.3 仪器

全自动生化仪（日本Olympus AU400），全自动血球计数仪（日本Sysmex XT2000i），全自动半薄切片机（德国Leica RM2265），全自动染色机（德国Leica ST5020），显微镜（德国Leica DM3000）。

1.4 方法

急性经口毒性试验、遗传毒性试验及大鼠30 d喂养试验均参照 《食品安全性毒理学评价程序和方法》GB15193-2003的相关试验方法[13]进行。采用最大耐受剂量法（MTD）进行小鼠急性经口毒性试验，SPF级健康昆明种小鼠20只，雌雄各半。按该软胶囊内容物 0.9 g/ml比重计算，剂量为 18 000 mg/（kg·BW），观察动物的中毒表现和死亡情况；小鼠精子畸形试验和小鼠骨髓细胞微核试验均设10 000、5000、2500 mg/（kg·BW）3个剂量组和环磷酰胺阳性对照组及阴性对照组，每组动物10只。观察小鼠精子畸形率及小鼠骨髓微核率，如出现明显的剂量-反应关系并有统计学意义，即确认为阳性结果；大鼠30 d喂养试验设670.0、335.0、167.5 mg/（kg·BW）3 个剂量组 （分别相当于人体推荐剂量的100、50、25倍）和1个玉米油对照组，每组动物20只，雌雄各半。分笼饲养，记录进食量，灌胃量为 0.5 ml/（100 g·BW），连续灌胃 30 d 后试验结束。处死大鼠，观察血常规、血清生化学指标和病理检查。病理组织学检查时先对高剂量组和对照组动物的主要脏器进行，如果发现病变后需对较低剂量组相应的器官及组织制片检查。

1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件对数据进行分析，小鼠精子畸形试验数据采用秩和检验分析，骨髓细胞微核试验数据采用泊松分布均数比较法分析，大鼠30 d喂养试验数据采用单因素方差分析和组间比较。

2 结果

2.1 小鼠急性经口毒性试验

给予受试物后连续观察14 d，未见动物死亡，提示该雨生红球藻软胶囊 MTD＞18 000 mg/（kg·BW），急性经口毒性分级属无毒级。

2.2 遗传毒性试验

2.2.1 小鼠精子畸形试验 受试物各剂量组与阴性对照组的小鼠精子畸形率在1.51%～1.72%之间，环磷酰胺阳性对照组为5.28%，各剂量组动物精子畸形率与阴性对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05），而阴性对照组与环磷酰胺阳性对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01），提示未见该受试物对雄性小鼠的精子产生致突变作用。

2.2.2 骨髓细胞微核试验 受试物各剂量组与阴性对照组的微核发生率在0.8‰～1.4‰之间，环磷酰胺阳性对照组的微核发生率为24.4‰。各剂量组骨髓细胞微核率与阴性对照组相比较差异均无统计学意义（P＞0.05），而阴性对照组与环磷酰胺阳性对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01），提示未见该受试物对小鼠的骨髓细胞有损伤和抑制作用。

2.3 大鼠30 d喂养试验

试验期间各组动物未见明显中毒表现，大鼠生长发育良好，试验结束时，无动物死亡。各剂量组大鼠终末体重、总增重、总进食量、食物利用率、白细胞总数、血小板、红细胞总数、血红蛋白以及各项血清生化指标与对照组比较接近，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表1～4）。各剂量组大鼠脏器重和脏体比值在正常值范围内，且与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）（表5）。

表1 受试物对大鼠体重、总增重、进食量、食物利用率的检查结果比较（±s）

表1 受试物对大鼠体重、总增重、进食量、食物利用率的检查结果比较（±s）

组别 初重（g） 终末重（g） 总增重（g） 总进食量（g）总食物利用率（%）雄性组（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油对照组雌性组（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油对照组75.7±4.4 75.8±5.3 75.7±6.3 75.9±4.8 331.8±19.6 333.2±14.5 335.1±14.6 337.7±17.1 256.1±17.3 257.4±13.9 259.4±10.4 261.8±15.4 705.5±52.5 713.6±47.8 714.7±72.2 715.9±63.9 36.4±2.4 36.1±1.8 36.6±3.1 36.7±2.0 74.2±5.7 74.1±7.1 74.1±6.8 74.3±4.7 232.2±18.5 235.4±16.7 231.4±13.3 233.3±14.8 158.0±14.3 161.3±11.0 157.3±10.2 159.0±13.6 594.2±37.6 601.2±45.5 593.2±43.6 596.1±58.7 26.6±1.1 26.9±1.0 26.6±1.8 26.8±2.3

表2 受试物对大鼠血常规指标的检查结果比较（±s）

表2 受试物对大鼠血常规指标的检查结果比较（±s）

性别 白细胞总数（×109/L）血小板（×109/L）红细胞总数（×1012/L）血红蛋白（g/L）雄性组（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油对照组雌性组（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油对照组8.18±0.84 8.27±1.18 8.16±0.53 7.93±1.11 858.7±87.2 854.7±174.7 832.2±153.9 851.8±173.0 7.27±0.48 7.59±0.87 7.36±0.81 7.54±0.66 144.2±9.3 148.6±18.4 144.2±17.2 146.9±12.3 8.17±1.19 8.59±1.30 8.27±0.91 8.63±0.90 874.3±122.1 834.6±125.2 878.2±118.5 850.3±139.9 7.34±0.61 7.54±0.70 7.20±0.53 7.55±0.70 142.6±11.6 147.9±15.2 140.9±10.6 146.0±14.4

2.4 病理学检查

所有动物进行大体检查，均未发现明显病变。对受试物的670.0 mg/（kg·BW）剂量组和阴性对照组动物的主要脏器进行组织病理学检查，结果见图1。大鼠的肝小叶组织可见肝细胞轻度脂肪变性（剂量组有3只、玉米油对照组有4只），可见肝细胞点状坏死（剂量组有1只、玉米油对照组有1只），大鼠的肝脏汇管区可见少量炎细胞浸润（剂量组有1只、玉米油对照组有2只）；大鼠的肾脏皮质部间质可见少量炎细胞浸润（剂量组有2只、玉米油对照组有2只）。以上两组动物组织病变轻且病程相似，故可以排除与受试物相关。动物的其他脏器脾、胃、十二指肠、睾丸及卵巢等组织未见病理组织学改变，提示该受试物对大鼠的上述脏器组织无损害作用。

表3 受试物对大鼠血液生化指标的检查结果比较（±s）

表3 受试物对大鼠血液生化指标的检查结果比较（±s）

性别 天冬氨酸氨基转移酶（U/L）丙氨酸氨基转移酶（U/L）尿素氮（mmol/L）肌酐（μmol/L）雄性组（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油对照组雌性组（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油对照组130.0±13.4 128.7±13.1 134.7±9.0 133.9±10.3 44.0±5.1 47.8±3.4 42.5±6.6 47.2±9.1 6.21±0.52 6.14±0.61 6.12±0.74 5.98±0.89 43.5±5.0 43.9±3.9 44.2±4.3 41.1±5.1 133.4±14.5 136.9±14.4 137.2±14.0 131.6±15.4 45.3±6.4 46.1±8.3 44.9±4.3 44.7±5.8 5.96±0.64 6.13±0.50 6.10±0.61 6.05±0.30 45.6±5.2 41.7±7.0 43.3±5.3 45.1±6.5

表4 受试物对大鼠血液生化指标的检查结果比较（±s）

表4 受试物对大鼠血液生化指标的检查结果比较（±s）

性别 胆固醇（mmol/L）三酰甘油（mmol/L）总蛋白（g/L）白蛋白（g/L）血糖（mmol/L）雄性组（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油对照组雌性组（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油对照组2.19±0.28 2.35±0.40 2.16±0.45 2.23±0.36 0.96±0.27 0.97±0.29 1.06±0.16 1.04±0.34 67.2±4.7 67.5±8.6 68.2±6.2 67.1±7.0 32.0±3.5 31.7±5.8 32.8±4.6 33.1±3.8 5.82±0.67 5.91±0.44 5.77±0.50 5.71±0.51 2.28±0.35 2.22±0.30 2.14±0.47 2.34±0.30 0.99±0.46 0.98±0.40 1.13±0.34 1.10±0.20 67.9±4.2 66.6±7.6 66.1±7.3 66.9±5.8 32.6±4.3 33.4±3.1 32.0±2.1 32.6±3.0 5.56±0.40 5.96±0.70 5.81±0.85 5.75±0.30

表5 受试物对大鼠脏器重量和脏器/体重比的检查结果（±s）

表5 受试物对大鼠脏器重量和脏器/体重比的检查结果（±s）

性别 肝脏湿重（g） 肝体比（%）雄性组（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油对照组雌性组（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油对照组9.93±1.26 9.79±0.95 9.88±0.89 9.99±1.08 3.10±0.44 3.03±0.28 3.04±0.29 3.05±0.37 6.86±0.38 7.13±0.46 7.02±0.52 6.98±0.72 3.07±0.33 3.14±0.33 3.14±0.27 3.09±0.28肾脏湿重（g） 肾体比（%）2.53±0.40 2.55±0.22 2.63±0.30 2.59±0.20 0.78±0.11 0.79±0.07 0.81±0.09 0.79±0.07 1.78±0.24 1.82±0.33 1.78±0.24 1.77±0.18 0.80±0.10 0.80±0.14 0.80±0.12 0.79±0.08脾脏湿重（g） 脾体比（%）0.75±0.07 0.72±0.08 0.74±0.09 0.73±0.08 0.23±0.03 0.22±0.02 0.23±0.03 0.22±0.03 0.51±0.04 0.50±0.05 0.53±0.06 0.51±0.05 0.23±0.03 0.22±0.03 0.24±0.03 0.23±0.02睾丸湿重（g） 睾体比（%）3.13±0.31 3.06±0.35 3.15±0.39 3.06±0.37 0.97±0.07 0.95±0.09 0.97±0.12 0.94±0.13

图1 大鼠的肝脏和肾脏组织病理学改变（HE染色）

3 讨论

国内外对红球藻毒性研究报道中的剂型各有不同[14-18]。虾青素是一种天然的类胡萝卜素，分子式为C40H52O4与β-胡萝卜素相似[19-20]。类胡萝卜素不溶于水，溶于脂肪和脂肪溶剂，因此雨生红球藻做成软胶囊剂型的保健品，对人体吸收利用较为合理。

本试验中，雨生红球藻软胶囊最大给药剂量达18 000 mg/（kg·BW）下，未见动物有中毒症状和死亡，急性经口毒性为无毒级，反映体内生殖细胞和体细胞遗传毒性试验的小鼠精子畸形试验和小鼠骨髓细胞微核试验结果均为阴性。30 d喂养试验中，大鼠生长发育良好，总增重、进食量、食物利用率、血常规和血液生化等指标等均未受明显影响。组织病理学检查大体解剖正常，镜下观察到的病变属动物的自发轻型病变，提示该雨生红球藻软胶囊未见产生毒副作用。

雨生红球藻为新资源食品，遗传毒性试验还应兼顾原核和真核细胞、体内和体外试验相结合的原则增加Ames试验、V79/HGPRT基因突变试验、程序外DNA修复合成（UDS）试验，为进一步观察其长期毒性作用，可进行90 d喂养试验、繁殖试验、代谢试验等研究。