慢性阻塞性肺疾病患者肋间外肌线粒体相关功能的临床研究

叶斌 李福祥

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种局部气流受限为特征的肺部疾病，表现为呼吸道或肺实质炎性反应，可进一步发展成为肺心病和呼吸衰竭，严重影响患者的日常生活和工作[1-3]。COPD发病率和死亡率较高，居全球致死性疾病第四位[4-5]，预计到2020年，其将上升至第三位[6]。因此，加强对COPD的防治意义重大。

COPD主要是多种细胞因子和炎症介质(如IL-1、IL-8、TNF-α等)[7-10]以及黏附分子(如CD11b/CD18、β2整合素等)[11-15]共同参与和发展所致。COPD不仅会导致肺部受损及肺功能下降，也常会引起肺外不良反应，尤以营养不良和呼吸肌功能障碍为主。线粒体作为机体活动和代谢所需能量和自由氧主要提供者，在呼吸肌功能障碍中起到至关重要的作用[16]。那么营养不良是否会导致机体所需能量不足，从而加重COPD病情，目前尚无相关研究。本文旨在探讨不同营养状况COPD患者呼吸肌线粒体功能，以期为COPD防治提供指导。

资料与方法

一、研究对象

于2016年1月至2016年12月收治于成都军区总医院呼吸科及胸外科且符合入选条件的COPD患者20例。其中低BMI COPD(BMI<18.5)患者10例，年龄46～84岁，平均年龄(58.4±14.8)岁；正常BMI COPD患者10例(18.5

二、诊断标准

诊断标准参照慢性阻塞性肺疾病全球倡议(global initiative for obstructive lung disease, GOLD)颁布的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2016修订)》和中华医学会呼吸病学会慢性阻塞性肺疾病学组织的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2013修订)》：对患者进行详细的病史采集，包括症状、接触史及既往史和系统回顾，症状包括慢性咳嗽、咳痰和气短，既往史和系统回顾包括童年期有无变态反应性疾病、感染及其他呼吸道疾病史，接触史包括吸烟史、职业环境等，并根据上述资料综合分析确定；COPD确诊的金标准：肺功能检查，吸入支气管扩张剂后，FEV1/FVC%<70%，可以确定患者存在持续气流受限。

三、纳入排除标准

1. 纳入标准： ①符合上述诊断标准者；②年龄40～85岁者；③无肺心病者；④患者完全知情且能积极配合本实验者。

2. 排除标准： ①伴有支气管哮喘或其他呼吸系统疾病患者；②伴有冠状动脉疾病；③伴有慢性代谢性、肾、心脏疾病或神经肌肉疾病；④近3个月内有全身类固醇治疗史，或影响肌肉结构和功能的药物；⑤近1月有呼吸道感染史；⑥胸廓畸形。

四、临床方法

1. 三组患者基本情况评估

(1)肺功能检查： 所有患者均接受常规肺功能检测，测定用力肺活量、肺活量、第1 s用力呼气容积(FEV1)、1秒率、弥散功能等。

(2)血气分析： 血气分析血样从患者桡动脉抽取2 ml，应用血气分析仪测定患者血气指标(pH、PaO2、PaCO2)。

2. 肋间外肌基本情况评估: 患者全麻后，行胸腔镜术或开胸手术，取第4肋间的肋间外肌组织，分成四份。精密称取1 g组织用于测定IL-6、IL-8和TNF-α表达水平；选取2 mm×2 mm×2 mm组织置于10%甲醛固定，行光镜检测肋间外肌形态；称取1 g新鲜肋间外肌提取线粒体，测定线粒体蛋白含量、呼吸链Ⅰ-Ⅳ和超氧化物歧化酶SOD活性、线粒体膜通透性转换孔(MPTP)动力学；选取1×1×1毫米组织置于3%戊二醛4 ℃保存，送四川大学电镜室检测肋间外肌线粒体形态。

3. IL-6、IL-8和TNF-α的测定: 将选取的肋间外肌组织剪碎、冲洗、研碎，反复冻融裂解组织细胞，5 000×g离心5 min，取上清，-20 ℃保存，应用IL-6、IL-8和TNF-α试剂盒，按实验步骤测定。

4. 肋间外肌形态学观察: 将选取的肋间外肌组，投入10%福尔马林中凝固24 h，按照脱水透明、浸蜡、包埋、切片、展片与贴片、脱蜡与复水、染色、水洗、分化、漂洗、封片与观察等步骤观肋间外肌形态学。

5. 肋间外肌线粒体功能评估: 应用组织活性线粒体分离试剂盒提取线粒体，应用纯化线粒体蛋白质浓度定量试剂盒测定蛋白浓度，应用线粒体复合酶Ⅰ-Ⅳ和超氧化物歧化酶SOD活性的测定试剂盒测定，应用线粒体通透性转换孔(MPTP)动力学测定

6. 肋间外肌线粒体结构的观察: 将选取作电镜观察的肋间外肌组织标本，按照固定、脱水、包埋、固定、切片、染色、透射电镜观察，拍片等步骤进行肋间外肌线粒体结构的观察。

五、统计学方法

结 果

一、患者病情评估结果

1. 三组患者基本情况比较： 三组患者的例数、性别、年龄和吸烟指数临床资料相比，差异无统计学意义(P>0.05)；低BMI COPD组的BMI指数值显著低于正常BMI COPD组和非COPD对照组(P<0.05)，而正常BMI COPD组与非COPD对照组无显著性差异(P>0.05)，见表1。

表1 三组患者基本情况比较

注：aP<0.05，与非COPD对照组相比；bP<0.05，与正常BMI COPD组相比

2. 肺功能评估结果: 三组患者肺功能参数测定结果，见表2。与非COPD对照组相比，COPD患者的肺功能参数值均明显降低(P<0.05)；低BMICOPD组和正常BMI COPD组患者的FVC(%)和VC(%)无显著性差异(P>0.05)，而FEV1(%)、FEV1/预测值、FEV1/FVC和DLco显著低于正常BMI COPD组(P<0.05)。

3. 血气分析结果: 三组COPD患者血气分析结果，见表3。血液pH指标结果显示：正常BMI COPD组与非COPD对照组无显著性差异(t=3.464，P=0.074)，而低BMI COPD组显著低于正常BMI COPD组和非COPD对照组(t=8.660，P=0.013 &t=12.124，P=0.007)；PaO2测定结果显示：COPD患者组显著低于非COPD对照组(P<0.05)，低BMI COPD组显著低于正常BMI COPD组(t=17.321，P=0.003)；PaCO2测定结果显示：正常BMI COPD组与非COPD对照组差异无统计学意义(t=2.784，P=0.108)，低BMI COPD组显著高于正常BMI COPD组和非COPD对照组(t=6.447，P=0.023 &t=4.409，P=0.048)。

表3 三组血气分析测定值对比±s)

注：aP<0.05，与非COPD对照组比较；bP<0.05，与正常BMI COPD组比较;cP<0.05，vs. 非COPD对照组相比

二、肋间外肌基本情况评估

1. 肋间外肌IL-6、IL-8和TNF-α浓度对比: 三组患者肋间外肌IL-6、IL-8和TNF-α浓度测定结果，见表4。COPD患者组的IL-6、IL-8和TNF-α表达水平显著高于非COPD对照组(P<0.05)，低BMI COPD组的IL-6、IL-8和TNF-α表达水平显著高于正常BMI COPD组(t=4.869，P=0.040 &t=7.491，P=0.017 &t=11.525，P=0.007)。

2. 肋间外肌形态学观察: 三组受试者肋间外肌光镜图，见图1。非COPD对照患者肋间外肌肌细胞规则排列，肌横纹清晰，细胞核分布于细胞边缘，呈扁椭圆形，间质细胞较少，胞质染色均匀，见图1a。正常BMI COPD患者肋间外肌肌细胞排列规则，肌横纹略微模糊，细胞质染色略微不均，间质细胞较正常人多，见图1b。低BMI COPD患者肋间外肌肌纤维间距增宽，呈不规则凹陷、分叶状，并可见玻璃样变性；间质细胞增多，局部肌横纹可见模糊，胞质染色不均，偶有细颗粒状、不规则空泡及旋涡状，见图1c。

表4 三组患者肋间外肌IL-6、IL-8和TNF-α浓度测定值±s)

注：aP<0.05，与正常组相比；bP<0.05，与正常BMI组相比;cP<0.05，vs. 非COPD对照组相比

三、肋间外肌线粒体功能评估

1. 肋间外肌线粒体蛋白含量: 三组受试者肋间外机线粒体蛋白含量测定结果显示， 低BMI COPD组为0.63±0.06 μg/ml， 正常BMI COPD组为1.21±0.07 μg/ml， 非COPD对照组为1.58±0.05 μg/ml。对照组肋间外肌线粒体蛋白含量显著高于COPD患者组(P<0.05)，而正常BMI COPD组线粒体蛋白含量显著高于低BMI COPD组(t=11.162，P=0.008)。

表2 三组患者肺功能参数比较±s)

注：aP<0.05，与非COPD对照组相比；bP<0.05，与正常BMI COPD组相比;cP<0.05，vs. 非COPD对照组相比

2. 肋间外肌线粒体复合物Ⅰ-Ⅳ和超氧化物歧化酶SOD活性的测定: 三组患者肋间外肌线粒体复合酶活性测定结果，见表5。与对照组相比，正常BMI COPD组的线粒体复合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和SOD活性均显著低于对照组(t=13.891，P=0.005 &t=16.338，P=0.004 &t=9.370，P=0.011 &t=22.200，P=0.002 &t=12.124，P=0.007)；低BMI COPD组线粒体复合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和SOD均显著低于正常BMI COPD组(t=24.305，P=0.002 &t=16.788，P=0.004 &t=8.730，P=0.013 &t=13.863，P=0.005 &t=9.418，P=0.011)。

表5 三组肋间外肌线粒体复合酶活性测定结果±s)

注：aP<0.05，与非COPD对照组相比；bP<0.05，与正常BMI COPD组相比;cP<0.05，vs. 非COPD对照组相比

3. 线粒体膜通道孔(MPTP)动力学测定: 非COPD对照组患者MPTP随着时间的进展，其吸光度值降低较少，而COPD患者组的MPTP减少较多，其中低BMI COPD患者MPTP降低最显著(P<0.05)，见图2。

图2 三组患者线粒膜通道孔吸光度比值比较

4. 肋间外肌线粒体形态学观察: 三组受试者肋间外肌线粒体电镜观察如图3所示。非COPD对照患者肋间外肌线粒体形状规则，外膜完整，嵴清晰可见，脂质空泡少见，未见胶原增生，图3a。正常BMI COPD组患者肋间外肌线粒体偶见基质密度下降、肿胀，嵴减少，外膜局部模糊、破损，脂质空泡及胶原未见明显增加，个别细胞现髓样变，图3b。低BMI COPD组患者肋间外肌线粒体数目略微增加，并呈簇状分布，部分线粒体可见肿胀，嵴变形，部分溶解，基质空泡化，偶见髓样变、胶原增多及脂质空泡增多现象，图3c。

四、相关性分析

1. FEV1与炎性指标的Pearson相关性分析： 将三组患者的FEV1与炎性指标(IL-6、IL-8和TNF-α)相关性分析，得患者FEV1与IL-6、IL-8和TNF-α呈负相关，见表6。

表6 FEV1与炎性指标的相关性

2. FEV1与线粒体指标的Pearson相关性分析: 将三组患者FEV1与线粒体指标进行相关性分析，得到患者FEV1与线粒体呼吸链复合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和SOD呈正相关，见表7。

表7 FEV1与线粒体指标的相关性

讨 论

近年来的研究发现，COPD病变的主要是以中性粒细胞、淋巴细胞和肺泡巨噬细胞浸润为主的小气道炎症[17-18]，在吸烟、感染和吸入污染的空气等的刺激下，气道上皮受损，支气管上皮细胞一方面分泌抗氧化和抗蛋白酶因子的功能下降[19]，另一方面IL-1、IL-8和TNF-α等多种细胞因子和炎性介质的释放增加，介导刺激信号传导至细支气管，使肺泡中性粒细胞和巨噬细胞活化，并趋化于支气管，而活化的中性粒细胞进一步释放IL-8，导致炎症信号逐级放大[7-8]，引起多种炎症因子的释放(如IL-6、IL-8和TNF-α等)，介导单核细胞趋化至肺，合成并释放急性期反应蛋白，如CRP、TNF-α等，引起COPD的发生和发展[20]。

COPD在导致患者肺部受损、肺功能下降的同时，也可导致肺外不良反应[21]，如营养不良、肌肉萎缩、心血管疾病等[22]。其中呼吸肌功能障碍是近年来的研究热点。骨骼肌功能紊乱(skeletal muscle dysfunction, SMD)是COPD患者常见的肺外不良反应[23]，导致COPD患者的运动受限[24-25]。研究表明，全身炎症、氧化应激以及细胞缺氧等多种因素都会引起肢体肌肉异常[26-28]，部分COPD患者常常出现肌肉损失，严重影响患者的生命健康及预后。营养不良导致患者呼吸肌结构和功能受损，呼吸肌疲劳，限制肺通气功能，引起患者进行性肌肉组织减少、呼吸肌萎缩。研究显示，COPD患者外周骨骼肌Ⅱ型纤维比例的增加和Ⅰ型纤维损害呈正相关[29]。近年来研究显示，多种细胞因子，如IL-6、IL-8和TNF-α等，对机体能量和物质代谢产生影响，引起COPD患者营养不良及呼吸肌功能紊乱[30-31]。Nguyen等[30]研究发现，营养不良COPD稳定期患者血清中及外周血单核细胞中TNF-α浓度均显著高于正常患者，TNF-α系统的激活与COPD营养不良存在密切联系。当机体受到炎症刺激时，IL-6浓度显著增高，损伤内皮血管，促进免疫黏附及微血管形成，抑制内皮修复，使血管受损加剧，肺功能恶化[32-33]。本研究发现，COPD患者组的IL-6、IL-8和TNF-α表达水平显著高于非COPD对照组，低BMI COPD组的IL-6、IL-8和TNF-α表达水平显著高于正常BMI COPD组。

光镜观察三组患者肋间外肌形态，发现正常人肋间外肌肌细胞规则排列，肌横纹清晰，细胞核分布于细胞边缘，呈扁椭圆形，间质细胞较少，胞质染色均匀；正常BMI患者肋间外肌肌细胞排列规则，肌横纹略微模糊，细胞质染色略微不均，间质细胞较正常人多；低BMI患者肋间外肌肌纤维间距增宽，呈不规则凹陷、分叶状，并可见玻璃样变性；间质细胞增多，局部肌横纹可见模糊，胞质染色不均，偶有细颗粒状、不规则空泡及旋涡状。上述结果说明COPD患者由于气道受限，导致机体缺氧，导致COPD患者的呼吸肌细胞形态发生不同程度变化，且低BMI COPD组的变化较明显。

肌肉的运动离不开线粒体源源不断地合成ATP。线粒体最主要的功能是氧化各种底物，使储存在其化学键中的能量进入ATP，提供机体活动和代谢所需的能量。COPD患者因为气道呼吸受阻，导致机体缺血、缺氧，可能会影响线粒体功能的发挥[34]。Sauleda等[35]研究报道了线粒体电子传递链的末端酶-细胞色素氧化酶(COX)的活性在COPD患者骨骼肌中表达上调，与动脉低氧血症呈正比。Gosker等[36]研究发现COPD患者骨骼肌中，促进质子泄露的蛋白通道，解偶联蛋白3(在ATP合成、能量耗散等中具有氧化磷酸化脱离功能)的表达降低。Ribera等[35]研究显示，在一些严重肺气肿患者分离得到的呼吸肌纤维中，线粒体电子传输增加，线粒体功能发生改变。本研究发现，低BMI COPD组和正常BMI COPD组患者肋间外肌线粒体蛋白含量、线粒体复合酶Ⅰ-Ⅳ的活性、超氧化物歧化酶SOD活性、MPTP动力学均显著低于非COPD对照组，而低BMI COPD组患者的线粒体蛋白含量、线粒体复合酶Ⅰ-Ⅳ及超氧化物歧化酶SOD的活性、MPTP动力学显著低于正常BMI COPD组，说明COPD患者肋间外肌线粒体功能受到一定程度的影响，营养不良患者线粒体功能出现障碍较严重。肋间外肌线粒体形态学观察显示：正常受试者肋间外肌线粒体性状规则，外膜完整，嵴清晰可见，脂质空泡少见，未见胶原增生。正常BMI COPD组患者肋间外肌线粒体偶见基质密度下降、肿胀，嵴减少，外膜局部模糊、破损，脂质空泡及胶原未见明显增加，个别细胞线粒出现髓样变。低BMI COPD组患者肋间外肌线粒体数目略微增加，并呈簇状分布，部分线粒体可见肿胀，嵴变形，部分溶解，基质空壳，偶见髓样变、胶原增多及脂质空泡增多现象。上述研究显示，与非COPD对照组相比，COPD患者的呼吸肌线粒体功能受到一定程度影响，且营养不良COPD患者呼吸肌线粒体功能受到的影响较严重。

由于呼吸肌功能与呼吸肌线粒体功能往往存在一定的关系，但本实验在研究BMI对肋间外肌线粒体功能的影响时，没有对呼吸肌功能进行深入研究，所以在后续研究中应对呼吸肌功能进行充分研究，探讨其在不同BMI的COPD患者中的不同，才能更好地为临床COPD的防治提供依据。