皮肤生物样本中角鲨烯的气相色谱法检测及气相色谱-质谱确证

陈云霞*， 闫 妍， 苏 宁， 王秀娟， 蔡天培， 郑 君，王 聪， 刘 娟， 于红梅

(中国检验检疫科学研究院，北京 100176)

人体皮肤用于保护体内各组织和器官免受外界有害因素的伤害，并能防止体内的水分以及营养物质等成分的流失，是人体的第一道生理屏障。皮肤中的脂质成分在保障皮肤屏障功能上发挥着至关重要的作用，当皮肤脂质成分或含量发生变化时，皮肤的屏障功能就会受到一定影响，进而影响皮肤的生理状态[1 - 2]。在皮肤病学领域，脂质成分对人体皮肤疾病的影响已经被证实，因此，脂类组学的研究逐渐成为了研究焦点[3 - 5]。研究表明，皮肤脂质成分的分泌过程，以及主要成分角鲨烯(Squalene)、神经酰胺(Ceramides,CERs)、甘油三酯(Triglycerides,TG)、游离脂肪酸(Free Fatty Acids,FFAs)等的含量、结构或比例变化，都会干扰皮肤的屏障功能[6]。皮肤屏障的最外层是水质膜，其中的脂质成分主要来自皮脂腺和汗腺的分泌，其中角鲨烯在皮肤水质膜中，又名三十碳六烯、鲨烯、鱼肝油萜等，是一种高度不饱和三萜类物质，是角质层中润泽脂质，在皮肤脂质中占12%，是皮肤保湿和抗衰老的重要指标，因此，角鲨烯的含量变化在一定程度上能指示皮肤的生理状态。

目前，对于角鲨烯含量的测定主要应用于植物油、鱼肝油等食品和保健品领域，文献报道角鲨烯的检测方法主要有气相色谱法[7 - 8]、气相色谱-质谱法[9 - 10]、液相色谱法[11 - 12]等。而对皮肤生物样本中角鲨烯含量检测鲜有报道。本研究建立了测定皮肤生物样本中角鲨烯的气相色谱分析及质谱确证方法，对于皮肤病学、脂类组学以及化妆品研究领域具有重要意义。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Agilent 6890型气相色谱仪(美国，Agilent公司)；-80 ℃冰箱(Thermo Scitifict公司)；皮肤贴片(美国，CuDerm公司)。

角鲨烯标准品(中国食品药品检定研究院)；正己烷、甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)；其他试剂均为分析纯。

1.2 标准溶液的配制

准确称取角鲨烯标准物质10 mg(精确至0.1 mg)，分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成浓度分别为1 000 μg/mL的标准储备液。将标准储备溶液稀释成质量浓度分别为2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100 μg/mL的系列混合标准溶液。

1.3 样品处理

1.3.1皮肤生物样本制备志愿者先经过洗头后，平衡30 min，采用tape-striping技术用贴片取得头皮样本，放入2 mL的离心管中，含样本的一侧向内，放入-80 ℃冰箱中保存，备用。

1.3.2皮肤样本预处理向有头皮样本的离心管中加入1 mL正己烷，旋涡提取1 min，经0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液供气相色谱测定。

1.4 仪器条件

1.4.1气相色谱条件色谱柱：Agilent HP-5柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；载气：高纯氮气；流速：1.0 mL/min；进样口温度：290 ℃，分流比：10∶1，压力：9.85 psi，隔垫吹扫流量：3 mL/min；火焰离子化检测器温度：300 ℃，空气流量300 mL/min，氢气燃气流量：30 mL/min，尾吹气流量：25 mL/min；升温程序：250 ℃保持1 min；15 ℃/min升到280 ℃，保持12 min；运行时间15 min。

1.4.2气相色谱-质谱确证条件气相色谱条件：Agilent HP-5MS柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；载气为高纯氦气；流速1.0 mL/min；进样口温度290 ℃，分流比10∶1，进样量1 μL；升温程序为250 ℃保持1 min；15 ℃/min升到280 ℃，保持12 min；运行时间15 min。质谱条件:接口温度 280 ℃；离子源温度 230 ℃；四极杆温度150 ℃；电离方式EI源；电离能量70 eV；全扫描监测模式检测，质量扫描范围m/z20～500；溶剂延迟3 min。

角鲨烯标准溶液的气相色谱图见图1。角鲨烯标准溶液的气-质确证谱图见图2。

图1 角鲨烯标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatogram of squalene standard solution

图2 角鲨烯标准溶液的GC-MS谱图Fig.2 GC-MS spectrum of squalene standard solution

2 结果与讨论

2.1 前处理与实验条件的优化

2.1.1生物样本的制备目前提取皮肤表面脂质的方法主要是通过医院渠道获得角质层碎屑，再进行有机溶剂提取分离，或是直接在皮肤表面用合适的有机溶剂萃取皮肤表面的脂质成分，或者直接刮取皮肤分泌物。由于上述方法取样困难、对皮肤刺激性大，本文选择使用脂带法，通过涂有粘性材料的贴片贴取含有角鲨烯的皮肤样本，放入2 mL离心管中，-80 ℃保存。

2.1.2提取溶剂的选择本实验考察了角鲨烯在乙腈、甲醇、正己烷、四氯化碳等有机提取溶剂的提取效果，涡旋提取时间均为1 min。角鲨烯易溶于非极性有机溶剂，经过比较发现，皮肤样本中角鲨烯能被正己烷和四氯化碳充分提取。综合考虑毒性和普适性，本研究选择正己烷为最佳提取溶剂。

2.1.3提取时间的选择在空白样品贴片中定量添加角鲨烯标准溶液，并放置至溶剂完全挥干。在2.1.1实验条件下，分别涡旋提取0.1、0.5、1、2、5 min，结果表明，随着提取时间的增加，提取效率先增加，但当涡旋提取时间超过1 min后，提取率基本保持不变，因此确定涡旋提取时间为1 min。

2.1.4色谱柱的选择角鲨烯沸点高，是难挥发性物质，且易溶于非极性有机溶剂，因此本研究选择普适性强，且分离该物质良好的HP-5弱极性色谱柱。HP-5色谱柱耐高温，柱流失小，通过较高初始柱温，可大大缩短样本中角鲨烯的分析时间。因此，综合考虑色谱峰分离度和分析时间，最终选择采用Agilent HP-5色谱柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)。

2.1.5程序升温条件的选择角鲨烯的沸点285 ℃，升温程序为250 ℃保持1 min，以15 ℃/min升到280 ℃，保持12 min，运行时间15 min。实验选择较高的初始温度，可以使低沸点物质迅速气化出峰，缩短目标物的分析周期。选择15 ℃/min的速率升至280 ℃，使得角鲨烯能够完全出峰，并能很好避免与干扰物质同时出峰。

2.2 方法学考察

2.2.1线性关系和定量限将角鲨烯标准储备溶液逐级稀释得到浓度为2、5、10、20、50、100 μg/mL的混合标准工作溶液，按1.4节的测定条件进样分析，以角鲨烯的峰面积(Y)对相应的浓度(X)绘制标准曲线，得到线性回归方程为：Y=2.05X+0.70，相关系数为0.9998，线性范围2～100 μg/mL方法的检出限(S/N=3)为1 μg，定量限(S/N=10)为2 μg。

2.2.2回收率和精密度以经过测定不含有角鲨烯的贴片空白样品为基质，分别进行空白样品添加回收率和精密度的测定。在2、4、20 μg三个加标水平下，每个水平平行测定6次，角鲨烯的平均回收率范围为96.0%～100.2%，相对标准偏差(RSD)为1.43%～3.79%。本方法在一日内不同时间和不同日期(5 d内)测得的日内和日间RSD分别为1%和2%。

2.3 质谱确证

图3 实际样本中角鲨烯检测结果Fig.3 Detection result of squalene in head skin sample

阳性样品需用气相色谱/质谱联用进行确认实验，如果皮肤样本中的角鲨烯色谱峰的保留时间与标准工作溶液一致(变化范围在±2.5%之内)，样品中角鲨烯的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过2.2.2的规定，则可判断样品中在相应保留时间内检出的物质为角鲨烯。

2.4 样品的测定

实验共选取20例头皮健康的志愿者(按八分法的评分标准，该组志愿者头屑评分≥2.5分)，其中男10例，女10例；年龄24～57岁。经相同洗发水洗发后，再平衡30 min，用tape-striping技术进行样本采集，得到相应的头皮生物样本。应用本方法，对其头皮样本中的角鲨烯含量进行测定，其结果见图3。

3 结论

本文建立了皮肤生物样本中角鲨烯的气相色谱分析方法及气相色谱-质谱确证方法，该方法具有操作简便、回收率高、精密度好等特点，满足皮肤生物样本中角鲨烯含量测定的需求，为生物样本中化合物的检验鉴定提供了较为实用有效的分析方法，为皮肤健康状况评价奠定基础。