恩诺沙星酶联适配体分析检测试剂盒的研制

赵秋伶， 张振宇， 周广原， 郑 昊

(1.辽宁工程技术大学矿业技术学院，辽宁葫芦岛 125105；2.辽宁工程技术大学电子与信息工程学院，辽宁葫芦岛 125105)

恩诺沙星(Enrofloxacin,ENRX)是一种人工合成的氟喹诺酮类抗菌药物[1]，被广泛用于畜牧生产和水产养殖中，预防和治疗各种动物感染性疾病[2]。ENRX的大量使用造成其在动物源性食品中残留，威胁人类的身体健康，如可引起神经中毒、肾功能损伤、过敏反应等毒副作用，且有潜在的致癌作用，还会使病菌产生耐药性[3 - 5]。世界各国均对喹诺酮类抗生药的最高残留限量(MRL)做出了严格限制。我国及美国均规定，牛、羊的脂肪与肌肉、奶、肾、肝中的MRL分别为100、100、200和300 μg/kg，猪、兔与家禽等其他动物的脂肪与肌肉、肝、肾中的MRL分别为100、200和300 μg/kg[6 - 7]。

目前文献报道的ENRX残留检测方法主要有微生物法、色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱法、荧光法和分光光度法、毛细管电泳法和免疫学检测法等[8 - 11]。免疫检测方法具有快速、灵敏、准确、分析成本底、样品前处理过程简单等优点，适合大样品量筛查，因而在实际生产中得到广泛的应用[12 - 13]。基于核酸适配体的酶联分析法是一种新型的免疫分析方法[14]，用核酸适配体代替传统抗体发展检测方法，可以进一步提高ENRX残留检测的灵敏度，另外核酸适配体不受外界环境的干扰，分析结果重现性高。本研究用自己筛选获得的ENRX核酸适配体作为识别探针，建立了一种用于检测动物源性食品中ENRX残留的竞争取代酶联分析方法。研制了ENRX酶联分析试剂盒，为ENRX残留检测提供一种新的参考方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与材料

Spectra Max Paradigm多功能酶标仪(美国，Molecular Devices公司)；Milli-Q超纯水系统(美国,Millipore公司)；Heal Force台式高速冷冻离心机、微量可调移液器(德国，Eppendorf公司)。

恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、加替沙星、氯霉素、莱克多巴胺(纯度>99%，中国兽医药品监察所)。ENRX核酸适配体序列，3′端生物素(biotin)标记：5′-GAAACGAGGTGCTTGACGGTACGATGTTATACCGGGTTAC-biotin-3′(A1)；和A1部分互补的核酸序列，5′端异硫氰酸荧光素(FITC)标记：5′-FITC-ATTACCGTCAAGCACCTC-3′(B1)；和B1完全互补的核酸序列：5′-biotin-GAGGTGCTTGACGGTAAT-3′(C1)，均购自上海生工生物工程有限公司。Anti-FITC-HRP购自美国Millipore公司；链霉亲和素修饰的酶标板和四甲基联苯胺(TMB)底物显色液购自美国Thermo Scientific公司；恩诺沙星酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒，购自江苏江莱ELISA研究所；其它试剂均为分析纯。实验用水为超纯水。

1.2 试剂盒的组装

试剂盒组成(96个反应/盒)见表1。使用方法如下：(1)固定DNA：首先向固定磷酸盐缓冲液(PBS)中加入A1 200 nmol/L和B1 500 nmol/L，于37 ℃孵育20 min形成部分互补的dsDNA。链霉亲和素修饰的酶标板用200 μL磷酸盐-吐温缓冲液(PBST)洗涤三次，每次5 min。然后在酶标板每孔加入100 μL含A1和B1的dsDNA溶液，置于37 ℃摇床，反应2 h。反应完毕移去反应液，凹槽用PBST洗涤三次，保留待用(凹槽1)。用相同的方法在另一链霉亲和素修饰的酶标板的凹槽上固定DNA C1(C1的浓度为300 nmol/L)，保留待用(凹槽2)。(2)检测ENRX：ENRX用结合缓冲液稀释成不同浓度，加入到待用凹槽1，每口100 μL，室温反应30 min；反应完毕，用移液器吸出反应液转移到待用凹槽2，37 ℃摇床反应20 min；然后移去反应液，用PBST洗涤三次，每次5 min，每口加100 μL anti-FITC-HRP，37 ℃反应30 min，移去反应液，洗涤三次，最后加100 μL TMB-H2O2底物显色液，反应20 min，加25 μL 2 mol/L H2SO4终止反应。反应液由蓝变黄，用酶标仪测450 nm波长处的吸光度。

表1 试剂盒的组成

1.3 食品样本检测

(1)添加回收实验：选取新鲜肌肉组织(高效液相色谱法已验证无ENRX)作为添加回收实验样品。其前处理方法如下：称取均质后肌肉组织3份，每份各1 g，置于3个15 mL离心管中，分别添加25、50、100 ng ENRX标准品，静置10 min后分别加入4 mL超纯水，充分振荡均匀，然后用离心机以10 000 r/min的转速离心10 min，分别吸取上层清液2 mL于3个10 mL离心管中，加入2 mL正己烷，振荡10 min，以10 000 r/min的转速离心10 min，除去上层正己烷层，取下层清液50 μL待测。

(2)实际样品检测：从兴城南关集贸市场采集鲜肉样本，共30份，依照添加回收实验的处理步骤处理鲜肉样品。用研制的试剂盒进行检测，同时用商用的酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒做对照和验证。

2 结果与讨论

2.1 检测策略

核酸适配体A1拥有40个碱基序列，前期的实验已经证明和ENRX作用的结合域包含在5′端的16个碱基里，而非后面的茎-环序列[15]。基于A1核酸适配体的结合域位于一端且不形成复杂结构的特点，我们设计了竞争取代酶联分析检测策略，见图1。当A1的3′端生物素标记可以被固定到链霉亲和素标记的酶标板上。B1共18个碱基，除了5′端的两个碱基之外，其余16个碱基和A1中5′端的16个碱基互补配对，见图1中A1和B1粗体部分。B1与A1能形成部分互补的dsDNA，通过杂交作用，B1也被固定到酶标板上。加入ENRX后，由于ENRX同其适配体的亲和力大于双链互补力，形成稳定的ENRX/aptamer复合物，FITC标记的B1自dsDNA上解离下来。取出含B1的溶液转移到固定了C1的酶标板凹槽，通过双链互补配对原则，B1被C1捕获。FITC能捕获带HRP标签的FITC抗体，HRP能催化TMB底物显蓝色，加入2 mol/L酸后蓝色产物转变为黄色。

图1 竞争取代酶联适配体分析的示意图Fig.1 Detection principle diagram of enzyme-linked aptamer assay with competition replacement mechanism

2.2 检测结果及标准曲线

图2 (A)检测不同浓度ENRX的照片；(B)450 nm的紫外吸收与ENRX浓度的关系曲线(插图(C)为(B)曲线中的线性部分)Fig.2 (A)Photographs of detecting different concentrations of ENRX;(B)Relationship between the UV absorption of 450 nm and the concentration of ENRX;(Inset:(C)is the linear part of (B) curve)The experimental conditions：[A1]=20 pmol/well,[B1]=50 pmol/well,[C1]=30 pmol/well,[ExoI]=5 U/well,[anti-FITC-HRP]=12.5 ng/well,[TMB]=1.2 mmol/L.The error bar represented the standard deviation of the three independent experiments.

在最优的实验条件下，竞争取代酶联适配体分析试剂盒测定不同浓度ENRX的实验结果见图2。由图2(A)照片可以看出，随着ENRX浓度的增加，溶液的颜色逐渐加深。肉眼观察的检测限为200 nmol/L(相当于72.0 μg/kg)。相应的，从图2(B)可以看出，随着ENRX浓度的增加，A450吸光度不断增大，开始时增加很快，后来趋于缓慢。在100～700 nmol/L(相当于35.9～251.6 μg/L)范围内，在450 nm处的净吸收值(A450-A450(blank))与ENRX的浓度呈良好的线性关系(图2(C))。以信噪比大于3为可测信号标准，经实验得到ENRX的检测限为75.0 nmol/L(相当于26.9 μg/L)。欧盟对ENRX在肌肉组织中的最大残留限量(MRL)作出明确规定，要求不高于30 μg/kg。我国对动物源性食品中ENRX的要求是肌肉组织中ENRX的MRL不高于100 μg/kg。所以，研制的试剂盒可以满足我国规定的检测需求，也能满足欧盟高标准检测需求。

2.3 试剂盒检测性能评价

2.3.1添加回收实验及精密度采用上述研制的酶联适配体分析试剂盒，对猪肉、羊肉、鱼肉进行检测，分别添加25、50、100 ng/g 3个浓度水平的ENRX，取同一批次包被板，对同种样品进行检测，计算批内变异系数，再取不同批次的包被板，对同种样品进行检测，计算批间变异系数，分别得到相同及不同批次样品的精密度，结果见表2。由表2可知所建立方法对实际样品检测的准确度和精密度良好，符合检测要求。

表2 鲜肉样品添加回收实验(n=5)

2.3.2特异性选择诺氟沙星、加替沙星、氧氟沙星、环丙沙星、氯霉素、莱克多巴胺作为参照物，在相同测试条件下，当ENRX的浓度为1 μmol/L，而其它物质浓度为10 μmol/L时，比较450 nm波长处的净吸收值(净吸收值=A450-A450(blank))，并计算交叉反应率P/N(P为对照物的净吸收值，N为ENRX的净吸收值)。由实验结果可知，交叉反应率P/N均小于4%，与环丙沙星、氧氟沙星和诺氟沙星的交叉反应率分别为3.46%、2.89%和2.33%，与其他结构类似物和功能类似物的交叉反应率均小于2%，说明除了加入恩诺沙星的体系外，其它体系检测结果的净吸收值都没有明显的提高(即使其它6个参照物浓度提高了10倍)，表明该方法对ENRX的检测具有较高的特异性。

2.3.3稳定性试剂盒经-20 ℃到室温的反复冻融后的测试结果显示，反复冻融60次后An/A0为0.86，0.86>0.8，说明检测体系的净吸收值没有明显变化，即试剂盒稳定性良好。

2.3.4保存期限试剂盒保存前测得的净吸收值为A0，试剂盒保存一段时间取出后测得的净吸收值为Am，计算Am/A0，当Am/A0≤0.8时，认定试剂盒失效。由表3有效期试验结果可知，试剂盒在37 ℃，保存一周失效。试剂盒在4 ℃可以保存半年以上，试剂盒在-20 ℃可保存3年。

表3 试剂盒有效期实验结果

2.3.5成本分析试剂盒中的成分除了DNA和Anti-FITC-HRP都是常规试剂。就目前合成技术，DNA已能够批量合成，合成2 OD用量时上去一个碱基10元左右，做96口反应需DNA 0.4～0.6 OD；100 μL Anti-FITC-HRP 395美元，做96口反应需2 μL足够。再加上其它试剂，一个能做96口反应的试剂盒大约四百元，比市售的常规酶联免疫分析试剂盒便宜。随着DNA合成技术的进步，如果能在DNA上直接标记HRP，将不必使用Anti-FITC-HRP，还将大大降低成本。

2.4 食品样品检测

应用本试剂盒检测兴城南关农贸市场采集的30个鲜猪肉样本，结果18个样本检出有ENRX残留，其中5个样本的残留量在42.3～100.2 μg/kg之间，低于我国规定的最大残留限量，13个样本的残留限量在101.3～182.0 μg/kg之间，高于我国规定的最高残留限量。我们研制的试剂盒的检测结果和商用的ELISA试剂盒检测结果基本一致，ELISA试剂盒也检出18个样本有ENRX残留，残留量在40.1～158.4 μg/kg之间。说明研制的试剂盒可信度高，能用于检测实际样本中的ENRX残留。

3 结论

本文研制了ENRX的酶联适配体分析检测试剂盒，该试剂盒的检测限为26.9 μg/L，线性检测范围为35.9～251.6 μg/L；应用于各样品的添加回收率均落在93%～110%之间，批内和批间变异系数均小于15%；与结构类似物和功能类似物的交叉反应率都小于4%；在-20 ℃环境中，能保存3年以上，在4 ℃环境中，能保存6个月以上；稳定性好，抵抗反复冻融至少60次。本文研制的试剂盒的灵敏度高、特异性强，具有准确、快速、简便的优点，能够满足动物源性食品中ENRX的快速筛查的需求。