固相萃取-气相色谱/质谱法测定蔬菜中77种农药残留

张 权， 周贻兵， 林 野， 李 磊， 刘利亚， 刘文政， 吴玉田， 郭 华

(贵州省疾病预防控制中心中心实验室,贵州贵阳 550004)

样品前处理是农药残留分析检测的关键步骤，目前样品前处理方法正朝着简单化、节约化和微型化发展[1]。常用的农药多残留前处理技术主要有基质固相分散萃取[1]、固相萃取[2]、凝胶渗透色谱[3]以及QuEChERS法[4]等。QuEChERS法是一种快速、简便、价格低廉的样品前处理方法，广泛应用于果蔬中的农药多残留检测[5]。但串联质谱法测定水果及蔬菜中多组分农残的相关标准还未正式颁布，因此，定量的仲裁依据仍为单级质谱法[6]。本研究筛选出对蔬菜基质净化效果较好的石墨化炭黑/氨基柱(PC/NH2)，结合气相色谱-质谱法(GC-MS)，建立同时测定蔬菜中77种农药残留量的分析方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

Scion-TQ液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(美国，BRUKER公司)。Carb/NH2固相萃取柱(500 mg/6mL，杭州富裕科技服务有限公司),Cleanert PC/NH2固相萃取柱(1 000 mg/6mL,天津博纳艾杰尔公司)Pro Elut TPC固相萃取柱(6 mL，迪马公司)。

PL2005农药混标1(51种，日本株式会社)；其余26种农药标准品均购于农业部环境保护科研监测所。无水Na2SO4、NaCl(优级纯，天津科密欧试剂公司)；甲醇、乙腈、丙酮(色谱纯，美国TEDIA公司)。分别吸取77种农药(68种有机磷及9种氨基甲酸酯)标准溶液，用丙酮溶解并定容至10 mL，配制成单标准溶液，然后吸取不同体积的单个标准溶液混匀，配制成混合标准溶液，-4 ℃保存。

1.2 样品制备

称取20.0000 g试样于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈，于15 000 r/min匀浆提取1 min，提取两次后，加入5 g NaCl再匀浆提取1 min，再10 000 r/min冷冻离心5 min，取上清液20 mL旋转蒸发浓缩至1 mL左右，待净化。在Cleanert PC/NH2柱中加入约2 cm高无水Na2SO4，加样前先用5 mL乙腈-甲苯溶液(3+1)预洗柱后，迅速将样品溶液转移至净化柱中，收集洗脱液，氮吹至近干，加入1 mL正己烷，混匀，用于GC-MS测定。

1.3 GC-MS条件

GC条件：Agilent J&W DB-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气：氦气，纯度≥99.999%；不分流进样，进样口温度：250 ℃。MS条件：电子轰击离子源(EI)，电离能量：70 eV，分析模式：SIM，离子源温度：230 ℃，传输线温度：280 ℃，恒线速度：44 cm/s，进样量：1.0 μL。程序升温条件：起始温度50 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至180 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升至240 ℃保持4 min，最后以10 ℃/min升至280 ℃保持4 min。溶剂延迟时间7.0 min。

表1 77种农药保留时间及质谱条件参数

(续表1)

No.PesticideRetention time(min)CAS No.Scan time(ms)Quantitative mass(m/z)Qualitative mass(m/z)46Isocarbophos21.3424353-61-51513612112011047Trichloronate21.47327-98-045109297269-48Fosthiazate21.8598886-44-31519916619528349Isofenphos-methyl21.8499675-03-31505812119924150Chlorfenvinfos22.08470-90-61526729532326951Isofenphos22.3725311-71-115213255185-52cis-Chlorfenvinphos22.4218708-87-710026729532326953Phenthoate22.572597-03-71527424632027754Quinalphos22.6313593-03-81514629815715655Methidathion23.09950-37-830014515730212556Propaphos23.247292-16-215220304262-57Tetrachlorvinphos23.3422248-79-91532933133310958Butamifos23.6936335-67-815286200232-59Fenamiphos23.9122224-92-615303288217-60Mocap24.1034643-46-41516230926723961Profenofos24.2641198-08-715339374297-62Fensulfothion25.64115-90-215293292308-63Ethion25.90563-12-215231384199-64Sulprofos26.4335400-43-230156322280-65Triazophos26.46122-14-515161172257-66Famphur26.6352-85-7152181252179367Edifenphos26.8617109-49-830173310201-68Pyridaphenthion28.61119-12-01519918820434069Carbosulfan28.7055285-14-84516011816316470Phosmet28.71732-11-6251601619315971EPN28.992104-64-51515716932318572Anilofos29.0064249-01-0100184226334-73Piperophos29.0924151-93-730140320122-74Phosalone30.412310-17-01512136715418475Azinphos30.486-50-01510416013212576Pyraclofos32.4877458-01-610028336019413877Coumaphos34.0356-72-415362226334109

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂体积及提取次数优化

大多数的农药残留检测的前处理都采用乙腈作为提取溶剂[7 - 8]。本研究在空白蔬菜基质中添加各组分浓度为278 μg/mL的混合标准溶液1 mL，以乙腈为提取溶剂，分别比较10 mL×2次、20 mL×1次和20 mL×2次的提取效果，结果以3次的平均值计算，以回收率作为验证指标。结果显示当提取溶剂为20 mL时，2次提取的回收率较高。

2.2 净化条件的选择及优化

利用空白蔬菜基质探究了不同种类固相萃取柱的净化效果。结果显示，针对小白菜基质经Carb/NH2柱(500 mg/6mL)、Cleanert PC/NH2柱(1 000 mg/6mL)及Pro Elut TPC柱(6mL)净化后的效果较好，能够去除大部分杂质。3种净化效果较好固相萃取柱的添加回收率结果显示，利用PC/NH2柱(1 000 mg/6mL)的净化效果要优于Carb/NH2柱(500 mg/6mL)及TPC柱(6 mL)的净化效果，77个目标组分的添加回收率在60%～120%内，可满足于定量分析的要求。本实验均以Cleanert PC/NH2柱作为蔬菜及果汁样品的净化柱。另外，本研究还考察了淋洗液的体积对回收效率的影响(其他条件不变，淋洗液分别为6、9、12、15、18 mL)，结果表明当淋洗液为12 mL时，各组分的回收率结果相对较高，且大多数目标组分均未超过100%，所以实验中用12 mL乙腈-甲苯溶液(3+1)分三次淋洗。

2.3 基质效应

基质效应对于复杂基质样品分析非常重要[9]。本研究同时选取两组分别由溶剂和空白小白菜基质溶液配制的混合标准工作溶液，GC-MS测定后，绘制标准工作曲线，计算基质效应:ME=Y/X×100%。X为纯溶剂中目标物的平均响应值，Y为空白样品基质中加入相同含量标准品时的平均响应值。当ME值等于或接近100%时，表明不存在基质效应的影响；当ME值大于100%时，表明存在离子增强作用；当ME值小于100%时，表明存在离子抑制作用[10]。在77种目标组分中，19种化合物的ME在100%～140%之间，基质效应明显增强，因此，本文使用基质匹配的标准溶液在一定程度上可消除基质效应对目标物测定的影响。具体的蔬菜基质加标(7.58 μg/kg)后的总离子流图如图1所示。

图1 蔬菜基质加标(7.58 μg/kg)样品在选择离子监测(SIM)模式下的总离子流(TIC)色谱图 Fig.1 TIC chromatogram in SIM mode of a vegetable matrix spiked(7.58 μg/kg) sample Note(1-77):The peak mark in the figure corresponded to that in table.

2.4 线性范围、检出限和定量限

配制75.75、151.5、303.0、606.0、909.0 μg/mL的混合标准基质溶液，现配现用。采用标准品的保留时间和相对离子丰度比进行定性，基质匹配外标法定量。结果如表2所示，77种目标物的线性关系良好(R2>0.99)，检出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)分别为0.0003～0.004、0.001～0.013 mg/kg。

2.5 加标回收率

取空白小白菜样品，分别添加3.79、7.58和30.3 μg/kg的混合标准溶液，按优化后的条件处理和分析，平行测定6次。结果显示，77种化合物加标回收率范围在60.3%～124.5%之间，RSD(n=6)在0.9%～9.1%之间。

表2 77种化合物线性方程、相关系数、方法检出限和定量限

(续表2)

No.PesticideLinear regression equationR 2LOD(mg/kg)LOQ(mg/kg)21Carbofurany=2861.7524x+501620.99120.0020.00522Simaziney=10738x-581460.99080.0020.00523Cyanophosy=62502x+21463000.99930.0010.00424Fonofosy=62953x+20959000.99840.00030.00125Diazinony=24755x+22226000.99680.0010.00226Disulfotony=27263x-843770.99930.0020.00727Isazophosy=16684x+212880.99830.0030.00928Etrimfosy=24823x-5142.47020.99840.0030.00929Pirimicarby=63565x+954400.99830.0020.00530Phosphamidony=1577.4078x+307110.99630.0020.00631Dichlofenthiony=28210x-1123300.99880.0020.00532Chlorpyrifos-methyly=22709x-830.65650.99980.0020.00533Parathion-methyly=3847.7195x-414650.99810.0020.00534Tolclofos-methyly=65640x-191270.99910.0010.00435Alachlory=20890x-323870.99930.0030.01036Fenchlorphosy=22980x-154490.99960.0020.00737Pirimiphos-methyly=19610x-692540.99930.0020.00538Fenitrothiony=5133.9868x-106230.99760.0020.00639Phorate sulfoxidey=45079x-32462000.99970.0000.00140Malathiony=9034.7246x-1285800.99750.0020.00541Phorate sulfoney=27438x-3426400.99920.0030.01042Clorpyrifosy=9373.3750x-834370.99980.0020.00643Fenthiony=35230x-2088700.99980.0020.00544Parathiony=3249.9412x-637560.99500.0020.00745Mirexy=120.5001x-165930.99080.0030.00846Isocarbophosy=2633.1538x-3695400.99380.0020.00547Trichloronatey=4791.4556x+2995500.99230.0020.00648Fosthiazatey=34173x-3525100.99960.0010.00349Isofenphos-methyly=24888x+3145900.99880.0030.00850Chlorfenvinfosy=15879x-1932100.99880.0020.00751Isofenphosy=23223x-2884400.99960.0020.00552cis-Chlorfenvinphosy=14211x-984040.99890.0030.00853Phenthoatey=13306x-3080900.99950.0030.01054Quinalphosy=20800x-170670.99960.0020.00555Methidathiony=9200.8623x+1647000.99250.0010.00456Propaphosy=29423x-5733900.99550.0010.00357Tetrachlorvinphosy=3347.3740x-296090.99200.0040.01158Butamifosy=6485.7856x-1028200.99580.0040.01259Fenamiphosy=4643.6235x-882720.99020.0020.00660Mocapy=1.1448x-186110.99960.0030.00961Profenofosy=2113.6936x-305690.99690.0020.00562Fensulfothiony=4761.3125x-408010.99810.0030.00863Ethiony=21597x-5981700.99700.0020.00764Sulprofosy=10781x-2675900.99830.0020.00665Triazophosy=4911.1753x-916700.99440.0020.00566Famphury=5842.0264x-6953.24950.99600.0040.01167Edifenphosy=966.6445x+2.71870.99570.0020.00768Pyridaphenthiony=2510.8672x-426100.99400.0030.00869Carbosulfany=6062.8892x+467960.99900.0030.01070Phosmety=4697.8174x-1513500.99660.0020.00571EPNy=7659.2324x-1.514700.99720.0020.00772Anilofosy=6354.2740x-236560.99200.0020.00773Piperophosy=5341.0903x-1215800.99730.0020.00774Phosaloney=1425.2905x+500510.99420.0030.00890Azinphosy=16661x-4743200.99480.0020.00776Pyraclofosy=91.9160x+2306800.99300.0030.00877Coumaphosy=180.7940x-141580.99240.0030.008

*Y：peak area of target compound；X： mass concentration of target compound,μg/L.

2.6 实际样品分析

采用本研究建立的方法对2017年贵州省食品风险监测所送检的的60份样品进行监测，在1份蔬菜样品中检出毒死蜱农药，其含量为为20.05 μg/kg，超过食品风险监测评估种的限值要求。

3 结论

本研究比较了农药残留分析中常用的固相萃取柱的净化效果，筛选出对蔬菜基质净化效果较好的固相萃取柱，建立了结合气相色谱-质谱法同时测定蔬菜中77种农药残留量的方法。该方法前处理步骤简便，特异性强，回收率稳定，适合蔬菜及水果基质中多组分农药残留的筛查和确证。