碱性磷酸酶的酶学性质研究及其在心肌标志物免疫检测中的应用

刘秀菊

（广东省深圳市龙岗区妇幼保健院 检验科，广东 深圳 518000）

碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AP）是一种水解酶，在碱性环境中能水解很多磷酸单酯化合物。该酶的用途广泛，它可以作为某些疾病的标志物，也经常用于在酶联免疫吸附反应（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA） 中标记抗体或抗原，进而帮助检测相应的抗原或抗体的含量。碱性磷酸酶的酶学性质已经得到广泛研究，如从不同物种中提取此酶，研究它的Km和Vmax值、最适pH和最适反应温度等基本性质，从而比较不同物种之间碱性磷酸酶的差异[1-3]。但是对碱性磷酸酶活性的其他影响因素（如缓冲液、NaN3、聚乙二醇等）研究较少。另外，这些实验多采用分光光度法跟踪碱性磷酸酶催化对硝基苯酚磷酸盐在水溶液中水解生成对硝基苯酚的反应，都是基于产物在水溶液中的摩尔吸光系数不变的情况下来测定酶的活性。不同种类、浓度和pH的缓冲溶液对产物的摩尔吸光系数影响很大，这直接影响到文献中有关碱性磷酸酶活性研究的准确性，因此有必要进行报道。

急性心肌梗死是一种发病率和死亡率很高的疾病。它的常用标志物有肌红蛋白、肌酸激酶、心肌肌钙蛋白（cardiac troponins,cTn）I、T，C-反应蛋白（C-reactive protein,CRP）等。其中，cTnI是当今公认的“黄金标志物”。2000年，欧洲心脏病学会和美国心脏病学会进一步强调了cTn家族（I、T）的检测对于急性心肌梗死的确诊是十分必要的[4-5]。CRP的用途非常广泛，它不仅可以用于诊断心肌梗死，还常用于各种慢性感染、组织损伤、恶性肿瘤、风湿及手术创伤等疾病的辅助诊断和治疗检测[6]。因此，对cTnI和CRP的定量检测备受重视。

本文分析了不同缓冲液、叠氮化钠（NaN3）、聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）对AP酶促反应动力学的影响，并且建立了碱性磷酸酶的心肌梗死标志物cTnI、CRP的双抗体夹心式ELISA检测体系，为碱性磷酸酶的实际应用提供有价值的信息。

1 资料与方法

1.1 主要试剂

小牛肠碱性磷酸酶（30 u/µl）购于宝生物工程(大连)有限公司，对硝基苯酚磷酸二钠（p-nitrophenyl phosphate hexahydrate disodium,PNPP）购于美国Amresco公司，cTnI质控品和CRP标准品以及cTnI的抗体（检测抗体16A11、包被抗体19C7）购于芬兰Hytest公司，CRP抗体（检测抗体4C28C6、包被抗体4C28C2）购于美国International Immunology Corporation公司，用于去除酶-抗体结合物中游离酶的试剂盒（FreeZyme Conjugate Purification Kit）、脱盐柱（D-Salt Polyacrylamide 6000 Desalting Columns）、用于合成酶-抗体结合物的交联剂LC-SMCC（Succinimidyl-4-［N-Maleimidomethyl］cyclohexane-1-carboxy-［6-amidocaproate］）以及β-巯基乙胺（β-mercaptoethylamine，MEA）购于美国的Pierce公司，其他试剂均为国产分析纯。

ELISA试剂：包被液TBS（0.025 M Tris,0.15 M NaCl，pH 7.4），封闭液TBS+1% BSA（w/v），稀释液TBS+0.5% BSA（w/v）+0.05%吐温20（v/ v），洗涤液TBS+0.05%吐温20（v/v），终止液1 M NaOH。

1.2 对硝基苯酚摩尔吸光系数的测定

对硝基苯酚（p-nitrophenol,PNP）是在碱性磷酸酶催化下底物PNPP的水解产物，该产物呈黄色，在405 nm处有强烈吸收。本研究选用了5种常用的缓冲液：碳酸钠/碳酸氢钠（Na2CO3/NaHCO3）缓冲液（0.1 M，pH 9.8），三羟甲基氨基甲烷/盐酸（Tris/HCl）缓冲液（0.05 M，pH 9.8），巴比妥钠／盐酸缓冲液（0.1 M，pH 9.8），硼砂/氢氧化钠（Na2B4O7/NaOH）缓冲液（0.05 M，pH 9.8），二乙醇胺（DEA）/盐酸缓冲液（1.0 M，pH 9.8）。将PNP溶解在这5种缓冲液中，配成浓度为1、2.5、5、7.5、10 µM的溶液，测其在405 nm处的吸光度。以PNP溶液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作图，所得斜率即为产物在该缓冲溶液中的摩尔吸光系数。本文还研究了不同浓度和pH的DEA缓冲液对PNP摩尔吸光系数的影 响。

1.3 碱性磷酸酶活性的研究

在2.5 ml的反应体系中，缓冲液2.025 ml，底物PNPP（100 mM）0.375 ml，碱性磷酸酶（30 mu）0.1 ml，pH为9.8，在37℃下，测定405 nm处的吸光度变化，通过上述体系，研究缓冲液、pH、NaN3、PEG对酶促反应的影响，并测定其动力学常数。

1.4 PEG对碱性磷酸酶稳定性影响的研究

将碱性磷酸酶液和PEG混合，使PEG在酶液的浓度为100 mg/ml，50℃水浴，每隔一定时间取出0.1 ml混合液，参考1.3的反应体系，测碱性磷酸酶活性，比较该酶在50℃的活性变化及不同分子量的PEG对其稳定性的影响。

1.5 碱性磷酸酶在检测cTnI和CRP的双抗体夹心式ELISA中的应用

1.5.1 碱性磷酸酶-抗体结合物的制备 碱性磷酸酶（25 u/µl，20 µl）和 LC-SMCC（50 mg/ ml，10 µl）混合，室温反应1 h，形成被活化的酶，过脱盐柱，去除多余的LC-SMCC，收集被活化的酶。抗体（11.3 mg/ml，0.09 ml）和MEA（250 mg/ ml，10 µl）混合以生成Fab，室温反应1 h后，过脱盐柱，去除多余的MEA，收集Fab组分。将被活化的酶和Fab组分按一定摩尔比（标记cTnI和CRP抗体的摩尔比分别为4︰1和1︰1）混合以合成酶-抗体结合物，4℃过夜后，用FreeZyme Conjugate Purification Kit去除游离酶，将收集到的酶-抗体结合物保存于该试剂盒提供的贮存缓冲液，并与等量的乙二醇混匀，置于-20℃冰箱中保存。

1.5.2 检测cTnI和CRP的双抗体夹心式ELISA方法的建立及性能评价 建立检测cTnI和CRP的ELISA检测体系。采用棋盘法，进行以下条件的筛选：包被抗体浓度（1、5、10、100 µg/ml），封闭液浓度（0.1%、0.5%、1%、3%、5%BSA溶液），cTnI酶-抗体结合物稀释度（1︰10、1︰20、1︰100、1︰1 000），CRP酶-抗体结合物稀释度（1︰100、1︰1 000、1︰2 000、1︰5 000），PNPP 浓度（10、100 mM），酶与底物作用时间（10、20、30、50 min）。选择不同浓度梯度的cTnI和CRP，以cTnI或CRP浓度为横坐标，在405 nm处的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并测定该方法的灵敏度、线性范围、稳定性。

2 结果

2.1 缓冲液的种类、浓度和pH对产物摩尔吸光系数的影响

缓冲液的种类、浓度和pH对PNP的摩尔吸光系数都有一定的影响，而且产物的摩尔吸光系数随溶液的浓度增加而增加，也随溶液的pH增加而增加。见表1。

表1 缓冲液的种类、浓度和pH对PNP摩尔吸光系数的影响

2.2 不同缓冲液对酶促反应速度的影响

研究表明，碱性磷酸酶在这5种缓冲液显示不同的反应活性。在DEA缓冲液中的酶促反应速度最高。其他4种缓冲液中的反应速度仅能达到DEA缓冲液中的45%～62%。见图1。因此，在后续实验中，均选用DEA缓冲液作为反应介质。

图1 不同缓冲溶液对碱性磷酸酶的影响

2.3 NaN3对酶反应速度的影响

在反应体系中添加NaN3使其终浓度为5～30 mM，结果表明NaN3对碱性磷酸酶动力学常数Km和Vmax没有明显影响，证实碱性磷酸酶保存液中的NaN3作为防腐剂不影响酶的活性。

2.4 聚乙二醇对酶活性和稳定性的影响

PEG对碱性磷酸酶的动力学常数没有明显影响，但是不同分子量的PEG都能使酶的稳定性有一定的提高，如图2所示。但其稳定化作用与PEG的分子量没有明显的直接关系。见图2。

图2 PEG对碱性磷酸酶热稳定性的影响

2.5 碱性磷酸酶在检测cTnI和CRP的ELISA中的应用

检测cTnI的ELISA检测体系的最适条件为：包被抗体为10 µg/ml，封闭液为1%BSA，检测抗体-酶稀释度为1︰20，底物PNPP为10 mM，底物和酶作用时间为20 min。线性范围为0.45～75.2 ng/ml，批内变异系数≤4.74%，批间变异系数≤9.21%。检测CRP的ELISA检测体系的最适条件为：包被抗体为10 µg/ml，封闭液为1%BSA，检测抗体-酶稀释度为1︰5 000，底物PNPP为10 mM，底物和酶作用时间为20 min。线性范围为5～100 ng/ml。批内变异系数≤7.745%，批间变异系数≤11.73。见图3。

图3 检测cTnI和CRP的ELISA标准曲线

3 讨论

碱性磷酸酶是一种碱性水解酶，用途非常广泛，它可以作为某些疾病的标志物[4-5]，也经常被用于在ELISA中标记抗体或抗原，进而帮助检测相应的抗原或抗体的含量[6-7]。碱性磷酸酶的酶学性质已经得到广泛研究，但是对碱性磷酸酶活性的其他影响因素（如缓冲液、NaN3、聚乙二醇等）研究较少[8-10]。另外，这些实验多采用分光光度法跟踪碱性磷酸酶催化对硝基苯酚磷酸盐在水溶液中水解生成对硝基苯酚的反应，都是基于产物在水溶液中的摩尔吸光系数不变的情况下来测定酶的活性。本研究发现，不同种类、不同浓度和不同pH的缓冲溶液对产物的摩尔吸光系数影响很大，这直接影响到文献中有关碱性磷酸酶活性研究的准确性。

急性心肌梗死是一种发病率和死亡率很高的疾病。当今公认的“黄金标志物”是心肌肌钙蛋白（cardiac troponins I,cTnI）。2000年欧洲心脏病学会和美国心脏病学会进一步强调了cTn家族（I、T）的检测对于急性心肌梗死的确诊是十分必要的[11-12]。CRP的用途非常广泛，它不仅可以用于诊断心肌梗死，还常用于各种慢性感染、组织损伤、恶性肿瘤、风湿、手术创伤等疾病的辅助诊断和治疗检测[13]。因此，对cTnI和CRP的定量检测备受重视。

碱性磷酸酶的酶促反应试验中，产物PNP的摩尔吸光系数多采用一个定值（17.3 mM-1cm-1），因为普遍认为PNP的摩尔吸光系数不随反应介质及其浓度和pH值而改变[14]。本文还首次系统地研究了缓冲液的种类、浓度和pH对反应产物PNP的摩尔吸光系数的影响，发现不同种类、不同浓度和不同pH的缓冲液中产物PNP的摩尔吸光系数不同。因此，测定碱性磷酸酶的酶活性时要根据不同的反应条件选择产物PNP不同的摩尔吸光系数，以保证实验结果的准确性。在研究的5种缓冲液中，DEA缓冲液是激活型缓冲液，不仅能给碱性磷酸酶催化反应提供缓冲作用，还可以作为磷酸酰基的受体，提高催化反应的速度[15]。在碱性磷酸酶的应用中，参考这些最适条件，应用效率会得到很大的提高。NaN3是一种防腐剂，可以抑制微生物的生长，是碱性磷酸酶保存液的必备成分之一。研究发现，NaN3对碱性磷酸酶的动力学性质没有影响。聚乙二醇对酶具有一定的稳定化作用。

以上的酶学性质的研究对两种心肌标志物的ELISA检测体系的建立起到一定的帮助作用。cTnI和CRP免疫检测体系的建立，达到很好的检测灵敏度和精确度，这对开发心肌标志物的ELISA检测试剂盒有很好的应用价值。