手足口病信号转导和激活转录因子3表达研究*

2018-11-07 11:33李露怡严跃文李娟邓长柏
中国医学工程 2018年9期
关键词:白介素口病病毒感染

李露怡,严跃文,李娟,邓长柏

(1.广州医科大学附属第五医院 儿科,广东 广州 510700;2.中能建电力医院 儿科,广东 广州 510500)

手足口病(hand-food-and-mouth disease,HFMD)是儿科常见的传染病,多见于5岁以下小儿,表现为手足臀部疱疹、口腔溃疡和发热等,可由多种病毒感染所致,大部分为普 通型病例,少数为EV71型病毒感染所致重型病例,合并神经源性肺水肿、脑炎和心肌炎等,死亡率高,近年有爆发流行的报道。HFMD发病机制不清,本文通过检测患儿外周血细胞因子及其信号转导和转录激活因子3(signal transduction and activation of transcription 3,STAT3)和磷酸化的STAT3(P-STAT3)蛋白,探讨其发病机制,为临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

59例HFMD患儿,均是门诊初次就诊患者,男33例,女26例;年龄1~8岁,按照卫生部制定手足口病(2010年版)诊断标准入选,均为普通型病例。此外,在儿童保健科门诊体检收集30例健康小儿(同年龄、性别,具有可比性)外周血标本,作为对照组,分别检测其细胞因子和外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中STAT3、P-STAT3蛋白表达。

1.2 实验方法

1.2.1 相关试剂、仪器及来源 PBS冲洗液、细胞裂解液[1 M Tris-CI(pH 7.4)5 ml,0.5 M EDTA 2 ml,NaCl 0.876 g、NaN30.02 g,Triton-x 100 ml,加ddH2O至100 ml即可用]均购于武汉晶赛生物工程公司;白介素-6、10、17等单克隆抗体试剂盒全部购于美国eBioscience公司。抗STAT3和P-STAT3抗体(第一、二抗体分别是兔抗人和羊抗兔抗体)和Western blot试剂盒、ECL(化学发光增强试剂盒)全部购于eBioscience公司,美国真空转膜印迹系统、BioRad-Jeldoc2000图像分析系统等仪器。

1.2.2 标本上清液和外周血PBMC制备 抽取患儿静脉血5 ml,加入肝素抗凝管中,加入红细胞裂解液,离心分离(每分钟3 000转)10 min,取上清液储存冻存于-80℃冰箱中用于细胞因子检测;下部分用PBS缓冲液冲洗,制备PBMC。

1.2.3 PBMC中STAT3和P-STAT3蛋白提取 在PBMC中加入细胞裂解液100 µl,超声粉碎,12 000 rpm、4℃离心20 min,取上清液测浓度,-20℃~-70℃冻存。

1.2.4 ELISA实验方法检测和质量控制 检测细胞因子(IL-6、IL-10、IL-17):酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)具体操作步骤按试剂盒说明进行,即取用存储的血标本,加入一抗和生物素标记的二抗、温育、洗涕和显色,比色结果。为得到准确的结果,进行质量控制。首先保证各批标本合格,如标本存储时间少于6 个月,实验操作准确,再次进行预实验检测,取得质控血清和曲线图,并采用即刻质控统计学方法:如在相同实验条件下,多次(20次以上)检测,结果取均值加减2个标准差(x±2 s)为可靠值,大于95%值或小于5%值去掉。

1.2.5 Western blot检测STAT3和P-STAT3蛋白表达 取上述冻存的蛋白提取液50 µg,加等体积样品缓冲液经变性后点样、电泳及显影等步骤检测(见分子生物学操作手册和试剂盒说明进行),用β-actin做对照带,检测其对比光密度,先制定A590值标准曲线,再取100 µl,测量A590值,根据标准曲线得出样本蛋白质含量。抗TAT3和P-STAT3抗体(第一、二抗体分别是兔抗人和羊抗兔抗体)和Western blot试剂盒全部购于eBioscience公司。

1.3 统计学方法

用SPSS 16.0统计软件包分析。计量资料以均数±标准差()表示,两组样本均数比较采用t检验。P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HFMD患者白介素、STAT3和P-STAT3结 果

59例HFMD患儿急性期血中白介素均升高,与健康对照组比较,差异有统计学意义(P <0.05),见表1。

2.2 HFMD患者外周血单核细胞中STAT3和P-STAT3(Western blot)

59例HFMD患儿P-STAT3蛋白表达明显增强,较对照组明显升高,两者比较差异有统计学意义(P <0.05),见表1。具体表达图(Western blot)见图1和图2。

表1 HFMD患者白介素、STAT3和P-STAT3结果 ()

表1 HFMD患者白介素、STAT3和P-STAT3结果 ()

组别 例数 IL-6/(pg/L) IL-10/(pg/L) IL-17/(pg/L) STAT3 P-STAT3 HFMD 59 40±6.2 54±8.5 33±4.4 126.60±2.67 72.31±2.46对照组 30 17±5.5 23±3.4 19±4.2 125.90±3.70 0.00±0.000 t值 17.577 19.260 14.274 0.92 225.00 P值 0.001 0.001 0.001 0.324 0.001

图1 STAT3和P-STAT3蛋白表达(Western)

图2 STAT3和P-STAT3蛋白表达(Western blot)

3 讨论

手足口病是小儿常见的急性传染病,好发于4~7月份和10~11月份,与气温变化有关[1-2];近年来有爆发流行的报告,部分病例可出现并发症如脑炎、肺水肿等[3]。自从1957年加拿大首次报告以来,该病一直在全世界发生;研究表明,多种肠道病毒如科萨奇病毒、EV71病毒等均可导致HFMD[4],虽然经过几十年的研究,但其发病机制尚未完全清楚,值得进一步研究。

细胞信号转导与转录激活因子(STAT)是细胞因子在细胞内重要的信息传递分子(蛋白家族),其激活(磷酸化)后使细胞核基因激活和表达,产生效应[5]。研究表明STAT3是IL-6在细胞内的重要的信息传递分子,在感染、肿瘤、缺氧损害和免疫等疾病发挥重要的作用[6-9]。

手足口病临床表现为发热、手足部出现疱疹,其本质是炎症反应的结果。在笔者的前期研究中发现,手足口病患者血中前炎症介质(白介素-6、白介素-10、白介素-17、白介素-21)和Th17淋巴细胞等明显升高,促进疾病的发生发展[10]。目前在国内尚未见有HFMD患者白介素-6信号转导及转录因子3(STAT3)变化的报道;据此本文进行了研究,结果发现在HFMD组患者IL-6信号通路激活,即磷酸化的STAT3表达增加(72.31±2.46),而总的STAT3没有增加(HFMD组和健康对照组分别是(126.60±2.67)和(125.90±3.70),两组比较差异无统计学意义(P>0.05),磷酸化的STAT3在HFMD组中升高,和健康小儿组比较差异有统计学意义(P <0.05),说明细胞因子信号通路激活在HFMD发生中起重要的作用,病毒感染和STAT3变化的关系值得进一步研究。国内王艳等[11]在实验研究中发现:EV71病毒感染横纹肌肉瘤细胞,下调STAT3和P-STAT3,STAT3可影响多种病毒的复制;Hill等[12]报道,STAT3具有抑制EB病毒对B淋巴细胞溶解的作用;Read等[13]研究报道,病毒感染通过MAPK.NFKB和STAT3信号通路促进细胞癌变和发展;而丙型肝炎病毒感染通过STAT3途径导致肝脏损害[14]。因此,STAT3在病毒感染所致的疾病发生发展中起到双刃剑的作用。本研究证实手足口病的发生发展也通过STAT3途径,其信号通路激活可能促进外周血有核细胞分泌更多的细胞因子,促进HFMD的发生,STAT3有可能成为治疗靶标,具有一定的临床意义。 因此,STAT3与HFMD的关系值得进一步研究。

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