藜麦发酵工艺优化及活性研究

韩 林 杨人乙 胡 悦 蒋 维

(1. 重庆三峡学院生物与食品工程学院，重庆 404100；2. 渝东北特色生物资源开发利用工程中心，重庆 404100)

藜麦(Chenopodiumquinoa)又称昆诺阿藜、南美藜等，是一种原产于南美洲的蓼科类植物，约250个品种，有着5 000 多年的种植历史[1-2]。藜麦营养丰富，含有大量蛋白质、碳水化合物和其它活性成分，其蛋白质平均含量高达15%，高于大米、玉米、大麦等粮食作物，主要由白蛋白(35%)和球蛋白(37%)构成；淀粉含量约占藜麦总重的52%～69%，同时膳食纤维含量也高达7.0%～9.7%[1]。此外，大量研究[3-5]表明，藜麦中多酚含量也非常丰富，主要由槲皮素、芦丁、山奈酚、阿魏酸、原儿茶酚及香草酸等活性成分组成。研究[1,6]发现，藜麦具有抗氧化、抗炎、降血糖和减肥等多种生理功效，而这些功能活性与藜麦中丰富的营养成分，特别是多酚、黄酮及皂苷类物质密不可分。因此，提高藜麦中功能活性成分的含量便可大大增加其营养和经济价值。郭谋子等[2]研究表明，浸泡及催芽处理可提高藜麦中膳食纤维和黄酮类化合物的含量，使其营养更加均衡合理。然而国内外关于发酵处理对藜麦中活性成分如多酚的影响则鲜有报道。

本试验选用酵母菌对藜麦进行发酵处理，并利用响应面法优化其发酵工艺，考察各因素对藜麦发酵过程中多酚积累的影响。同时，应用HPLC对发酵前后藜麦中的主要酚类物质进行分析，比较发酵前后对藜麦抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性的影响，旨在探索提升藜麦营养和经济价值的新方法，为藜麦的深入开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

酵母菌：安琪酵母股份有限公司；

藜麦：山西稼祺农业科技有限公司；

槲皮素、芦丁、山奈酚、阿魏酸标准品：纯度为98%，上海源叶生物科技有限公司；

DPPH、ABTS：美国Sigma公司；

α-葡萄糖苷酶、pNPG：美国Sigma公司；

无水甲醇、过硫酸钾等其它试剂：国产分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

高效液相色谱仪：LC20A型，日本岛津公司；

电子分析天平：AL104型，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；

紫外-可见分光光度计：UEC0905005型，上海博普达仪器制造有限公司；

旋转蒸发仪：RE52-86A型，上海亚荣生化仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 总酚含量的测定 准确量取50 mL体积分数为60%的乙醇溶液，加入10 g藜麦发酵样品中，60 ℃条件下水浴提取30 min，离心后过滤，残渣再次提取2次，合并滤液，低压旋转浓缩至25 mL后进行总酚含量的测定。采用Folin-酚法测定藜麦发酵样品提取液中总酚含量[7]，具体操作为：准确移取1.0 mL提取液，加入1.0 mL Folin-酚显色剂，混匀后静置3 min，再加入1.0 mL浓度为1.0 mol/L的Na2CO3水溶液，用蒸馏水定容至10.0 mL，混合均匀，室温下避光放置1 h后于725 nm处测定吸光度，同时以芦丁作标准品得标准曲线线性方程为Y=2.817 5X-0.001 5，R2=0.993。藜麦发酵样品中总酚含量按式(1)计算：

(1)

式中：

c——发酵藜麦中总酚含量，mg/g；

m1——提取液中总酚含量，mg；

m2——藜麦发酵样品质量，g。

1.2.2 单因素试验

(1) 菌种添加量对总酚含量的影响：准确称取藜麦粉末10 g，分别按0.25%，0.50%，1.00%，2.00%，4.00%添加酵母菌，再加入20 mL蒸馏水，28 ℃下发酵48 h后，按1.3.1方法进行总酚的提取和测定。

(2) 发酵时间对总酚含量的影响：准确称取藜麦粉末10 g，酵母菌添加量为2.0%，加入20 mL蒸馏水于28 ℃发酵不同时间(24，48，72，96，120 h)后，按1.3.1方法进行总酚的提取和测定。

(3) 水分添加量对总酚含量的影响：分别称取藜麦粉末10 g，加入不同体积(10，15，20，25，30 mL)的蒸馏水，再加入2.0%的酵母菌，于28 ℃下发酵48 h后，按1.3.1方法进行总酚的提取和测定。

1.2.3 响应面优化试验 以单因素试验结果为基础，设计三因素三水平响应面试验，优化酵母菌添加量、发酵时间、水分添加量对藜麦发酵过程中总酚积累的工艺条件。

1.2.4 HPLC分析 色谱条件为： Waters Symmetry C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温30 ℃，检测波长280 nm。流动相A和B分别为：乙酸水(pH 2.6)、色谱甲醇，洗脱条件为：0～15 min，15%～25%流动相B；15～25 min，25%流动相B；25～65 min，25%～75%流动相B；65～80 min，75%～15%流动相B；流速为0.8 mL/min。根据保留时间和峰面积外标单点法进行定性和定量分析[8]。

1.2.5 抗氧化活性

(1) 对DPPH自由基的清除能力：根据文献[9]，修改如下：分别称取1 g藜麦发酵样品(响应面优化最佳条件下发酵所得)和未发酵藜麦样品，按1.3.1方法提取后，低压旋转浓缩，真空冷冻干燥。将真空冷冻干燥的提取物分别配制成8，16，24，32，40 mg/mL，准确吸取0.1 mL不同质量浓度的各样品溶液，加入3.9 mL DPPH溶液(25.61 mg/L)，室温避光反应30 min，利用紫外—可见分光光度计在517 nm处测定吸光度As。同时测定得到0.1 mL不同浓度的样品加入3.9 mL 70%乙醇后的吸光度Aj，以及空白吸光度Ac。按式(2) 计算DPPH自由基的清除率。

(2)

式中：

R——DPPH自由基清除率，%；

As——加入样品后的吸光度；

Aj——加入70%乙醇后的吸光度；

Ac——空白的吸光度。

(2) 对ABTS自由基的清除能力：根据文献[10]，修改如下：准确吸取0.1 mL不同质量浓度(1.0，2.0，4.0，8.0，16.0 mg/mL)的各样品溶液，加入3.9 mL ABTS溶液，混合均匀后室温反应6 min，置于734 nm处测定吸光度AE，同时进行空白试验得到吸光度AB。按式(3)计算ABTS自由基的清除率。

(3)

式中：

S——ABTS自由基清除率，%；

AB——加入样品后的吸光度；

AE——加入70%乙醇后的吸光度。

1.2.6α-葡萄糖苷酶抑制活性 根据文献[11]，修改如下：用0.1 mol/L pH 6.8的PBS缓冲液配制不同浓度的α-葡萄糖苷酶(3.0×10-7mol/L)和pNPG溶液(3.0×10-4mol/L)。准确移取25 μLα-葡萄糖苷酶溶液，分别加入25 μL不同浓度的样品提取物(0.4，2.0，10.0，51.0，128.0 μg/mL)，37 ℃恒温孵育15 min，再加入50 μL pNPG溶液(0.3 mmol/L)，37 ℃ 恒温孵育20 min，加入200 μL 0.5 mol/L Na2CO3终止反应，于405 nm处测定吸光值，并按式(4)计算各样品提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

(4)

式中：

I——抑制率，%；

AK——空白的吸光度；

AY——加入样品后的吸光度。

1.3 统计学分析

使用SAS 9.0软件对试验数据进行分析，采用单因素方差分析中的Duncan’s多重比较法分析结果间的显著差异(P<0.05表示具有显著性差异)。每组试验均重复3次，结果以(平均值±标准差)表示。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

酵母菌添加量、发酵时间和水分添加量对发酵藜麦提取物中总酚含量的影响见图1～3。随着酵母菌添加量的增加，藜麦经发酵后其总酚含量也逐步增加，但当菌种添加量超过2.0%时，总酚含量开始下降(图1)，说明低浓度的酵母菌发酵在一定时间内可显著提高藜麦中多酚含量，而浓度过高则会减少多酚的生成。在藜麦发酵前3 d，总酚含量几乎呈线性增加，最高可达5.79 mg/g，而发酵3 d后总酚含量则逐步减少(图2)，与李玉珠等[12]报道一致，可能与酵母菌对多酚的消耗和利用有关。此外，当水分添加量为15 mL 时，藜麦经发酵后总酚含量较高，可达5.50 mg/g，而过多或过少水分添加量都会影响藜麦发酵过程中总酚的积累(图3)。多酚通常以游离态和结合态形式存在于食物中，发酵过程中，微生物可分泌产生一些酶，作用于结合态多酚使其游离，同时也会利用部分多酚进行生长繁殖[8]，因此适当的发酵处理可提高藜麦中总酚的含量，增强其功能活性，后续响应面优化试验分别以酵母菌添加量2.0%，发酵时间3 d 和水分添加量15 mL作为中心值(见表1)进行发酵工艺条件的优化。

图1 菌种添加量对总酚含量的影响Figure 1 Effect of the amount of yeast on the content of total phenols

图2 发酵时间对总酚含量的影响Figure 2 Effect of fermentation time on the content of total phenols

图3 水分添加量对总酚含量的影响Figure 3 Effect of the amount of water on the content of total phenols

2.2 响应面法优化试验

采用三因素三水平响应面分析方法，优化菌种添加量、发酵时间和水分添加量对藜麦发酵过程中总酚含量的影响，结果见表2。利用SAS软件对结果进行分析可知，总酚含量对X1、X2和X3的二次多项回归方程为：

表1 响应面因素水平编码表Table 1 Variables and levels in response surface method

表2藜麦发酵响应面设计及结果

Table 2 Experimental design and result of central composite test on the fermentation of quinoa

试验号X1X2X3总酚含量/(mg·g-1)110-11.9082-1005.0493-1014.12641-102.81350005.29761103.718701-13.5238-1-103.59490113.629100004.854110005.283120-113.43413-10-12.245140005.310150-1-12.902161012.77717-1104.463

(5)

由表3可知，根据响应面试验结果拟合的回归模型达到极显著水平(P=0.001 2<0.01)，说明此模型与试验拟合较好，能较为准确、真实地反映试验结果，其复相关系数R2为0.95。显著性检测结果(表4)表明，在试验水平范围内，3个因素对藜麦发酵中总酚含量均会产生显著影响，其中菌种添加量(X1)影响最大(P值最小)，水分添加量(X3)次之，而发酵时间(X2)影响相对较小(P值最大)。同时，各因素之间的交互作用对总酚含量的影响均不显著(P>0.05)。

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance of the regression model

表4 二次多项式回归方程系数的显著性分析Table 4 Regression coefficients of predicted quadratic polynomial model

由SAS分析可知，当菌种添加量(X1)、发酵时间(X2)和水分添加量(X3)分别为1.7%、3.3 d(80 h)、15.8 mL时，总酚含量最大，为5.37 mg/g。选择菌种添加量1.7%，发酵时间80 h和水分添加量16 mL发酵藜麦，进行验证实验，3次平行结果得到藜麦在上述条件下经发酵后总酚平均含量为(5.31±0.11) mg/g，与模型预测值非常接近，相对误差仅为1.12%。同时，与未经发酵的藜麦总酚含量[(2.17±0.08) mg/g]相比，藜麦经优化发酵后，总酚含量可提高2倍之多。综上，本试验利用响应面法优化所得的模型与实际试验结果接近，可用于预测藜麦在发酵过程中总酚含量的变化情况，同时藜麦经发酵处理后，可大大提高其总酚含量，增加其营养价值，具有一定的应用和经济价值。

2.3 藜麦中主要酚类物质的分析

研究[13]表明，藜麦中含有丰富的多酚类物质，特别是芦丁、槲皮素及山奈酚等的含量比荞麦还高，而这些活性成分的含量直接影响着藜麦的生理功能。发酵前后藜麦提取物的高效液相色谱分析见图4。由图4可知，未发酵藜麦中芦丁含量较为丰富[(262.2±5.39) mg/kg]，发酵处理后其含量稍有下降[(219.5±11.39) mg/kg]，然而藜麦在发酵前几乎检测不到槲皮素，但经发酵后，槲皮素的含量[(113.4±8.73) mg/kg]显著增加，说明在发酵过程中许多槲皮素衍生物的糖苷键被破坏，形成了游离态的槲皮素。同时，发酵后的藜麦中含量较多的香草酸(44.7±2.54)mg/kg，藜麦中香草酸常常以结合态形式存在，一般不易提取[14]，本试验通过微生物处理可有效将藜麦中部分结合态的香草酸释放，易于机体的吸收利用。

1. 芦丁 2. 槲皮素 3. 香草酸 图4 藜麦提取物液相色谱图Figure 4 The liquid chromatogram of extraction from quinoa

2.4 抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基的清除作用 由图5可知，随着质量浓度的增加，样品对DPPH自由基的清除效果增强，并在试验浓度范围内呈一定的线性关系，R2分别为0.966 7(发酵藜麦)和0.995 2(未发酵藜麦)，同时藜麦经发酵后提取所得样品对DPPH自由基的清除率均显著高于未发酵藜麦提取物的(P>0.01)，其IC50值分别为16.42，39.48 mg/mL，说明发酵处理可提高藜麦中的抗氧化活性成分，研究[1]表明，藜麦中主要的酚类抗氧化活性成分为芦丁、槲皮素、香草酸和阿魏酸等，如2.3结果所示，发酵后藜麦中主要的酚类物质含量显著提高，因此增强了其自由基清除能力。

2.4.2 ABTS自由基的清除作用 由图6可知，与DPPH自由基清除效果相似，样品清除ABTS自由基的能力随质量浓度的增加而增强，发酵处理可显著提高藜麦提取物对ABTS自由基的清除能力，平均可增加31.97%的清除率，其IC50分别为1.51，6.66 mg/mL，提高了4.4倍。

图5 藜麦对DPPH自由基的清除作用Figure 5 The DPPH free radical scavenging activity of quinoa

图6 藜麦对ABTS自由基的清除作用Figure 6 The ABTS free radical scavenging activity of quinoa

2.5 α-葡萄糖苷酶抑制活性

α-葡萄糖苷酶是一种位于肠膜表面，可以分解碳水化合物，释放出葡萄糖的消化酶，抑制该酶的活性可有效降低餐后血糖水平，调节糖化学代谢[15]。由图7可知，藜麦发酵处理可显著提高其对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，相对于未发酵的样品，抑制率平均可提高12.41%。研究[16-17]表明，天然活性成分，如芦丁、槲皮素等均具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，而藜麦中则富含这些物质，并且经发酵后，槲皮素的含量显著增加，因此表现出更好的α-葡萄糖苷酶抑制作用。

3 结论

本研究以总酚含量为评价指标，利用响应面法优化了藜麦发酵工艺条件：菌种添加量1.7%，发酵时间80 h，水分添加量16 mL，各因素对藜麦发酵过程中总酚含量影响的程度依次为：菌种添加量>水分添加量>发酵时间。在此条件下，藜麦发酵后总酚平均含量为(5.31±0.11) mg/g，与模型预测值之间的相对误差仅为1.12%。藜麦经发酵处理后，可显著提高其中槲皮素和香草酸的含量，而对芦丁含量几乎没有影响。同时，发酵处理可以大大提高藜麦的抗氧化活性。藜麦发酵后对DPPH自由基的清除率显著提高，IC50为16.42 mg/mL，远小于未发酵的39.48 mg/mL；对ABTS自由基的清除效果同样也显著增加，提高了4.4倍。此外，发酵处理后，藜麦对α-葡萄糖苷酶的抑制作用也显著增强，抑制率平均提高了12.41%。

图7 藜麦对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Figure 7 The α-glucosidase inhibiting activity of quinoa

有关藜麦发酵工艺优化的研究报道甚少，本试验证实发酵处理可显著提高藜麦中的总酚含量，同时也大大增强了其生物活性，可为深入开发藜麦功能性食品提供思路。后续将对发酵处理影响藜麦中总酚含量的作用机制进行进一步的研究。