猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒GP5蛋白的原核表达

(山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030801)

0 引言

PRRSV属于套式病毒目(Nidovirales)，动脉炎病毒科(Arteriviridae)， 动脉炎病毒属，是带囊膜结构的单股正链RNA病毒[1]。ORF基因编码病毒的N端糖基化囊膜蛋白(GP5蛋白)，是重要的结构蛋白和免疫保护性抗原蛋白，参与细胞免疫与体液免疫[2]。

1 材料与方法

1.1 猪PRRSV GP5蛋白基因的优化和合成

根据Genbank中的猪PRRSV ATCC VR-2332株的GP5蛋白的序列，去除其31个AA的信号肽后，对其进行密码子优化，并在序列两端加入BamH I和Sal I限制性内切酶位点，优化后的序列交由上海生工生物技术公司合成。

1.2 pCold-GP5重组质粒的构建及鉴定

用质粒小提试剂盒提取重组质粒，进行双酶切鉴定，酶切体系为：10XFD FastDigest buffer 5 μL，BamH I 2.5 μL，Sal I 2.5 μL，重组质粒40 μL。反应结束后，对酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。

1.3 重组BL21的构建及鉴定

取2 μL 重组质粒pCold-GP5加入到100 μL的BL21，冰浴20 min，42℃热激90 s;冰浴3 min，加入500 μL LB培养基，37℃孵育30 min后，取100 μL涂布到含有Amp的LB平板，37℃，过夜培养。随机挑取6个单克隆，进行PCR鉴定。反应结束后，对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。

1.4 重组GP5蛋白的诱导表达及鉴定

诱导的菌液4 000 rpm离心10 min，用50 mL缓冲液(100 mM Tis-Hcl， 50 mM NaCl)重悬菌体，超声破碎菌体，12 000 rpm离心30 min，收集上清，0.22 μm 滤膜过滤，进行SDS-PAGE和Western blotting检测。

2 结果

2.1 重组质粒pCold-GP5的鉴定

将构建成功的重组质粒pCold-GP5，经 BamH I 和Sal I 双酶切后， 1%琼脂糖凝胶电泳，图 1显示酶切片段约为522 bp，与预计大小相符。

图1 重组质粒pCold-GP5的双酶切鉴定

2.2 重组BL21的鉴定

1%琼脂糖凝胶电泳如图2，在500 bp与750 bp之间有单一条带，与522 bp的GP5蛋白基因大小符合，说明挑选的重组BL21单菌落含有GP5蛋白基因。

图2 重组BL21的PCR鉴定

2.3 重组GP5蛋白的鉴定

结果如图3所示，19kD处有一明显条带，与预期大小一致。SDS-PAGE和Western Blot结果证明， GP5蛋白表达成功。

图3 表达产物的SDS电泳和Western blotting结果

3 讨论

稀有密码子会降低目的基因的转录水平，合适的密码子替换可以提高外源基因在宿主中的表达量[7]。

本研究为了提高GP5蛋白的产量，将GP5基因序列的密码子优化为大肠杆菌偏爱的密码子，构建了重组BL21菌株，利用IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE和Western bloting验证，成功获得了重组GP5蛋白。