真菌毒素胶体金检测试剂条质量研究

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(1.郑州中道生物技术有限公司,河南 郑州 450000； 2.河南省动物疫病预防控制中心，河南 郑州 450000)

0 引言

真菌毒素是真菌在生产繁殖过程中产生的次生有毒代谢产物，人或牲畜使用了被产毒真菌及其毒素污染的食品或饲料可引起中毒及某些慢性疾病，具有强烈的致畸性、致癌性、致突变性[1]。在GB 2761-2011《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》中规定，黄曲霉毒素B1(AFB1)在玉米糁中限量值为20 μg/kg、大米中限量值为10 μg/kg，饲料原料中的最低限量值为10～50 μg/kg，饲料制品的最低限量值为10～30 μg/kg[2-3]。免疫胶体金法较实验室高效液相色谱法(HPLC)，具有操作简单，快速，费用低廉的特点，且作为真菌毒素现场快速检测得到了国家食品药品监督管理局(现国家市场监督管理总局)的认可[4]。而对其性能指标的验证对该试剂条的临床实践的应用至关重要。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄曲霉素B1(AFB1)单克隆抗体、AFB1-牛血清白蛋白(BSA)、山羊抗小鼠IgG购自洛阳佰奥通生物技术有限公司，AFB1[GBW(E)100302]标准品购自国家标准物质中心，阴性盲样:实验室高效液相色谱法(HPLC)确定的不含AFB1的玉米糁空白样本50份，及0.5倍检出水平的阴性样本50份；阳性盲样：实验室HPLC法确证玉米糁加标至1倍检出水平和2倍检出水平的阳性样本各50份。

1.2 方法

1.2.1 真菌毒素免疫胶体金层析法试剂条的制备

通过将胶体金标记的单克隆抗体(以下简称金标抗体)喷在玻璃纤维上制成结合垫，将完全抗原和山羊抗小鼠IgG包被于NC膜上，分别作为T线和C线。按照图1，组成胶体金试剂条。

1样品垫;2结合垫;3NC膜;4吸水垫;5PVC底板图1 试纸条侧面结构示意图

1.2.2 真菌毒素免疫胶体金层析法试剂条的质量验证

(1) 真菌毒素胶体金检测试剂条检测限度的测定。取玉米糁2.0 g 15份，分别加入不同浓度的AFB1标准品，浓度分别为0、2.5、5.0、10和20 ng/g，每个浓度做3次重复。通过消线法判定结果，确定试剂条检测限度。

(2) 与结构类似物的特异性试验。用含15%甲醇的PBS缓冲液分别将真菌毒素结构类似物AFM1、AFB2、赭曲霉毒素A、T-2毒素、玉米赤霉醇制备成浓度为1.0、5.0、100和500ng/ml的溶液，用试剂条进行检测。

(3)实验室高效液相色谱法(HPLC)一致性评价。参照食品药品监管总局发布的《食品快速检测方法评价技术规范》(食药监办科〔2017〕43号)方法[5]，与实验室仪器HPLC方法进行产品的灵敏度、特异性、假阴性率和假阳性率、一致性分析。卡方检验统计分析显著性差异(χ2)。方法如表1所示。

表1 真菌毒素免疫胶体金层析法

2 结果

2.1 检测限的确定

玉米糁中AFB1加入浓度为2.5 ng/g时，结果显示阴性，而加入5.0 ng/g及以上浓度时，结果为阳性，说明样品检测限为5.0 ng/g。所有检测项目重复3次试验，结果均一致，检测限满足国标要求。

表2 试验结果

2.2 与结构类似物特异性试验

试纸条检测浓度小于灵敏度的AFB1标准品时，结果为阴性，检测浓度大于等于灵敏度的AFB1标准品时，结果为阳性;检测不同浓度的真菌毒素结构类似物，结果均为阴性，表明试纸条的特异性较好。

2.3 实验室高效液相色谱法(HPLC)一致性评价

本研究中的真菌毒素检测试剂条同实验室HPLC法比较，灵敏度99%，特异性97%，假阴性率为1%，假阳性率为3%，χ2=0.25，和实验室HPLC法无显著性差异。各个性能指标满足国家关于快检国标的技术参数要求。试验结果见表2。

3 讨论

本研究中的真菌毒素检测试剂条灵敏度高，达到符合国标要求的检测限值。与真菌毒素类似物无交叉反应，特异好。同实验室HPLC法比较，灵敏度99%，特异性97%，假阴性率为1%，假阳性率为3%，卡方检验统计分析，χ2=0.25，和实验室HPLC法无显著性差异。各个性能指标满足国家关于快检国标的技术参数要求，具有良好的应用前景。