骨髓间充质干细胞治疗对神经系统疾病免疫指标的影响及临床疗效

周小琳 李栋方 李平甘 罗向阳

中山大学孙逸仙纪念医院小儿神经内分泌专科（广州 510120）

目前许多神经系统疾病仍无有效治疗方法，如脊髓炎、格林巴利综合征、多发性硬化等，预后较差，致残率高，家庭、社会负担很重。近年来随着干细胞研究越来越深入，干细胞的多种治疗功能被人们发现和认识，干细胞治疗成为治疗神经系统疾病的热点。骨髓间充质干细胞（bone mar⁃row mesenchymal stem cells，MSCs）是骨髓中的一种干细胞，研究发现MSCs具有调节免疫和保护神经的作用［1］。MSCs具有自我增殖和多向分化能力，易于体外培养和扩增，具有较低的免疫原性，国内外已有不少应用骨髓问充质干细胞治疗神经损伤的研究。本实验前期研究发现，多种神经系统疾病存在免疫功能紊乱，抑制神经系统免疫炎症反应可能对疾病恢复有帮助［12］。本文就MSCs对神经系统疾病免疫功能的影响及临床疗效做初步探索。

1 对象与方法

1.1 研究对象 病例选自2014年11月至2017年11月我科住院部收治的患儿，共30例，其中脊髓炎10例，脑炎12例，格林巴利综合征4例，多发性硬化4例，年龄1～15岁。纳入标准：（1）患儿均有相应的临床症状，并符合神经系统影像学、脑脊液等检查的表征；（2）脊髓炎、脑炎、格林巴利综合征、多发性硬化均符合第8版《诸福棠实用儿科学》中神经系统疾病的诊断标准；（3）入选前均经医院医学伦理委员会审核通过，所有患儿家属均签署了知情同意书。排除标准：合并其他系统严重并发症，如心、肝、肾功能不全，或者严重过敏体质可能对MSCs过敏者。正常对照组为本院体检健康儿童30例，近期均无感染史、无自身免疫性疾病史和其他疾病史，其中年龄和性别构成比例与病例组差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 研究方法

1.2.1 MSCs治疗方法 所有病例组患儿均在传统治疗的基础上，加用MSCs进行治疗。MSCs 10× 106/次，静脉注射，1次/周，共4次。所有MSCs均由本院生物治疗中心采集、培养、冻存，所有标本在注射前均经过严格细胞学鉴定，除外感染、恶性病变等情况，符合使用标准。

1.2.2 免疫指标检测 在治疗前和治疗结束后空腹抽静脉血2 mL，在6 h内取抗凝全血40 μg，去除红细胞，加入 CD19+、CD20+、CD4+、CD8+单克隆抗体，室温下孵育20 min后上机检测。淋巴细胞亚群采用FACSCalibur型流式细胞仪（美国BD公司）检测。最后由CD4+、CD8+检测值计算CD4+/CD8+比值。

1.2.3 临床观察指标 对比治疗前后病例组患儿临床症状、神经功能、头颅MRI有无改善。

1.3 统计学方法 实验数据处理采用SPSS 21.0软件分析，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床疗效及头颅MRI改变情况 病例组30例患儿MSCs治疗结束后，24例临床症状改善，6例临床症状无明显改善。病例组30例患儿均存在头颅或脊髓MRI异常，治疗后25例病灶有改善。

2.2 病例组与正常对照组外周血免疫指标表达水平比较 与正常对照组相比，治疗前病例组患儿外周血CD19+、CD20+比例明显升高（均P＜0.05）；CD4+、CD4+/CD8+比例降低，CD8+T细胞百分比升高（P＜0.05）。见表1。

表1 病例组与正常对照组外周血免疫指标表达水平比较Tab.1 Comparison of expression levels of immune indexesin peripheral blood between case group and normal control group ±s，%

表1 病例组与正常对照组外周血免疫指标表达水平比较Tab.1 Comparison of expression levels of immune indexesin peripheral blood between case group and normal control group ±s，%

组别病例组正常对照组t值P值例数30 30 CD19+34.66±10.80 16.15±3.51 8.92 0.00 CD20+33.90±11.38 15.95±3.43 8.09 0.00 CD4+23.51±6.59 33.21±5.80 6.05 0.00 CD8+26.61±6.40 22.27±5.98 2.71 0.01 CD4+/CD8+1.08±0.45 1.60±0.48 4.27 0.00

2.3 症状改善组与症状无改善组治疗前后外周血CD19+、CD20+表达水平比较 病例组患儿经MSCs治疗后，24例症状明显改善，6例症状无明显改善。症状改善组外周血CD19+、CD20+比例较治疗前明显降低（P＜0.05）；症状无改善组该指标与治疗前相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 症状改善组与症状无改善组治疗前后外周血CD19+、CD20+表达水平比较Tab.2 Comparison of expression levels of CD19+and CD20+in the peripheral blood before and after treatment in theimprovement groupand the non⁃improved group ±s，%

表2 症状改善组与症状无改善组治疗前后外周血CD19+、CD20+表达水平比较Tab.2 Comparison of expression levels of CD19+and CD20+in the peripheral blood before and after treatment in theimprovement groupand the non⁃improved group ±s，%

注：a与b比较，c与d比较，P＜0.05；其余指标治疗前后比较，均P＞0.05

CD19+CD20+组别症状改善组症状无改善组例数24 6治疗前34.47±10.19a 36.82±15.10治疗后17.80±5.15b 35.6±15.57治疗前33.66±10.80c 35.68±15.83治疗后17.20±4.96d 35.00±14.11

2.4 症状改善组与症状无改善组治疗前后外周血CD4+、CD8+、CD4+/CD8+表达水平比较 症状改善组的24例患儿外周血CD4+、CD4+/CD8+比例较治疗前明显升高，CD8+比例较治疗前明显降低（P＜0.05）；症状无改善组患儿外周血CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比例与治疗前相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 症状改善组与症状无改善组治疗前后外周血CD4+、CD8+、CD4+/CD8+表达水平比较Tab.3 Comparison of expression level of CD4+，CD8+and CD4+/CD8+in peripheral blood before and after treatment in the improvement groupand and non⁃improved group ±s，%

表3 症状改善组与症状无改善组治疗前后外周血CD4+、CD8+、CD4+/CD8+表达水平比较Tab.3 Comparison of expression level of CD4+，CD8+and CD4+/CD8+in peripheral blood before and after treatment in the improvement groupand and non⁃improved group ±s，%

注：a与b相比，c与d相比，d与f相比，均P＜0.05；其余指标治疗前后比较，均P＞0.05

组别症状改善组症状无改善组例数24 6 CD4+治疗前23.33±6.95a 24.23±5.38治疗后31.85±6.15b 23.25±5.06 CD8+治疗前26.56±5.97c 26.80±3.74治疗后21.34±5.41d 26.15±4.72 CD4+/CD8+治疗前1.08±0.49e 1.10±0.27治疗后1.63±0.66f 1.00±0.23

3 讨论

中枢神经系统疾病的免疫改变错综复杂，在大脑发育过程中神经元和神经胶质细胞的产生受多种机制调节，免疫系统与大脑发育息息相关。T细胞、B细胞等免疫细胞从胚胎期开始就存在于大脑中，有报道中枢神经系统中的B细胞介导中风后的认知障碍，并可以通过分泌致病性抗体来防止脊髓损伤后的功能恢复［2］。B细胞在成人脱髓鞘疾病中也发挥有害作用，可以分泌针对髓鞘的自身抗体诱导脱髓鞘的发生［3］。T细胞具有介导大脑发育过程中神经元可塑性的能力，有报道显示在炎症致敏的缺氧缺血性新生儿脑损伤中，CD4+T细胞浸润受损的大脑并刺激小胶质细胞激活，从而加剧神经炎症反应［4］。有学者发现格林巴利综合征、多发性硬化患者的脑脊液中发现B淋巴细胞和T淋巴细胞比例异常，治疗后患者症状好转，B淋巴细胞和T淋巴细胞比例趋于正常［5］。本研究也发现脑炎、脊髓炎等中枢神经系统疾病外周血CD19+B细胞和CD20+B细胞比例与健康对照组相比明显升高，提示B淋巴细胞过度活化，体内免疫功能亢进；同时结果显示中枢神经系统感染时，CD4+T细胞及CD4+/CD8+比例降低，CD8+T细胞百分比升高，说明中枢神经系统感染存在T淋巴细胞免疫功能紊乱，这与既往学者研究结果相一致。结合本研究结果及国内外研究，B淋巴细胞和T淋巴细胞功能紊乱可能在中枢神经系统发病过程中起着重要的作用。

很多中枢神经系统疾病经常引起不同程度的功能障碍，临床上传统治疗很难治愈而且治疗的效果有限，近年来干细胞治疗神经系统疾病成为了热点。既往国内外很多研究证明，MSCs治疗神经系统疾病有效，MSCs可以促进损伤脑组织恢复，分泌神经营养因子并迁移至病灶处发挥神经保护作用［6-7］。在一项观察自体骨髓间充质干细胞移植治疗神经系统疾病的研究中发现，MSCs治疗后患者神经系统明显提高，随时间推移临床症状逐渐好转，不良反应较少［8］。有学者发现MSCs治疗多发性硬化患者临床有效率高，并且用多发性硬化患者自体骨髓MSCs培养扩增后再回输，可以达到同样的临床效果［9］。本实验小组前期研究发现MSCs能抑制EAE大鼠动物模型炎症反应，在临床上应用MSCs治疗多名多发性硬化患儿，在改善患儿运动功能、感觉障碍、延长疾病缓解期，减少复发等方面均取得了明显的效果，说明MSCs发挥了良好的神经免疫保护作用。本研究结果也显示MSCs治疗后症状改善组患儿外周血B淋巴细胞和T淋巴细胞指标均明显改善，而症状无明显改善组患儿外周血免疫指标与治疗前相比较无明显改变，MSCs治疗脊髓炎、脑炎、多发性硬化等神经炎症性疾病取得良好的临床疗效。

MSCs治疗神经系统疾病疗效确切，但其具体的治疗机制尚未完全清楚，有以下几种可能：（1）MSCs可以分化成为神经元样细胞，能够经血管内给药后迁移到损伤部位，并且可通过血脑屏障进入中枢神经系统发挥重要作用［10］；（2）MSCs可分泌出一系列强有力的旁分泌作用因子，通过提供营养支持、抑制炎症和调节免疫细胞功能来促进组织修复［11-12］，我们前期研究也发现MSCs在体外细胞实验中能抑制BV2小胶质细胞的炎症反应，发挥抗炎作用［13］；（3）如本结果研究所示，MSCs通过抑制外周血T、B淋巴细胞免疫功能发挥神经保护作用，比如分泌某些可溶性因子直接抑制B细胞增殖和趋化潜能［14］。

综上所述，外周血T、B淋巴细胞过度活化可能促进中枢神经系统疾病的病情发展。MSCs输注作为有效的免疫调节及神经保护的治疗手段，其低免疫原性提高了同种异体移植的可能性，同种异体MSCs移植均不引起淋巴组织增殖反应［15］，且培养简单，临床应用方便，在治疗神经系统疾病领域中有着良好的前景。