RhoA/ROCK1在多发性骨髓瘤中的表达及临床意义

吴春叶 罗友红 蒋端凤 何玉婵 高彤彤 黄勃 王晓桃

1桂林医学院第二附属医院（广西桂林 541100）；2桂林医学院附属医院（广西桂林 541100）

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一种骨髓浆细胞异常增殖引起的广泛浸润、难以治愈的疾病［1］，其骨质进行性破坏，临床主要表现为骨髓瘤骨病（myeloma bone disease，MBD），常伴有严重的骨质疏松、骨痛、病理性骨折等骨相关事件［2］。目前MBD的主要发生机制是在骨髓微环境中，瘤细胞与骨髓基质细胞通过经典途径如细胞核因子NF⁃κB受体活化因子（receptor activator of nuclear factor⁃kappa B，RANK）/RANK 配基（RANK ligand，RANKL）/护骨素（osteprotegerin，OPG）、骨架蛋白Axin和非经典途径如巨噬细胞炎症蛋白⁃1α（mac⁃rophage inflammatory protein 1⁃α，MIP⁃1α）等信号通路导致破骨细胞活性增强和成骨细胞功能受抑制，造成溶骨性病变，阻碍新骨生成［3-4］。RhoA属于Rho家族蛋白的重要成员，具有GTP酶活性，其下游Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶（Rho⁃associ⁃ated coild⁃protein kinase，ROCK）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，有两种同源性极高的异构体ROCK1和ROCK2，ROCK1主要存在肝、脾、骨骼肌等非神经组织中，是一种调节肌球蛋白轻链活性的激酶，导致肌动蛋白-肌球蛋白收缩，这是细胞运动和骨质破坏的基础［5-6］。有研究发现RhoA/ROCK1参与调控细胞形态、细胞骨架重构、细胞迁移等多种细胞功能［6-7］。而目前国内外关于RhoA/ROCK1在MM中的表达状态及机制研究尚未见报道，本研究旨在明确MM患者中RhoA/ROCK1的表达及与临床各指标的关系，试图探讨其在MBD中发生、发展的作用，为MM的发生机制及临床治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2017年4～12月在桂林医学院附属医院及第二附属医院住院治疗的46例MM患者骨髓标本作为实验组，其中男22例，女24例，年龄47～75岁，中位年龄61岁；其中初诊患者13例，复发难治患者33例；免疫分型：IgG 20例，IgA 16例，λ轻链型 24例，κ轻链型20例；Durie⁃Salmon，（D⁃S）分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期 6例，Ⅲ期 36例）；国际分期体系（International staging system，ISS）分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期17例，Ⅲ期15例。入组的MM患者因多种原因未行荧光原位杂交技术为基础的Mayo危险分层检查。实验组的MM患者诊断符合国际骨髓工作组的标准（2014年修订）。排除标准：（1）有严重心、肝、肾等重要脏器疾病病史；（2）有其他恶性肿瘤病史；（3）合并严重代谢性或感染性疾病；所有MM患者均进行全身或局部的X线检查确定有无骨质疏松或溶骨性破坏，若X线检查为阴性者，用电子计算机断层扫描、磁共振成像及全身骨扫描等检查，以X线为标准将MM进行分级［8］：1级10例（21.74%），2级6例（13.04%），3级30例（65.22%）。

选取同期住院初诊的原发免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia，ITP）20例患者骨髓标本为对照组，其中男9例，女11例；年龄48～68岁，中位年龄58岁。对照组的诊断符合中华血液学分会血栓与止血学制定ITP诊断与治疗中国专家共识的标准（2016年版），并常规行骨密度测定排除有骨质疏松或骨质破坏的患者。本研究经医院伦理委员批准，所有患者签署知情同意书，两组患者年龄、性别资料具有可比性。校正血钙值（αCa）＝血清钙值＋（40-血清白蛋白测定值）×0.025 mmol/L。

1.2 主要实验仪器与试剂 人外周血淋巴细胞分离液（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）、RhoA ELISA试剂盒（ELabscience公司），ROCK1 ELISA试剂盒（上海酶研生物科技有限公司），总RNA提取试剂盒（DP419）、FastKing cDNA第一链合成试剂盒（KR116）、SYBR GReen试剂盒（FP205）（北京天根生化科技有限公司），CFX96实时荧光定量PCR仪（Bio⁃Rad公司），Thermo Multiskan GO全波长酶标仪（Thermo公司），引物序列：RhoA上游：5′⁃GACTCGGATTCGTTGCCTGA⁃3′，下游：5′⁃TGGGAACTGGTCCTTGCTGA⁃3′，扩增片段 116 bp；ROCK⁃1上游：5′⁃CTGCAACTGGAACTCAACCAA⁃GAA⁃3′，下游：5′⁃GCTGGCCAACTGCATCTGAA⁃3，扩增片段138 bp；内参β⁃actin上游：5′⁃TGGCACCC⁃AGCACAATGAA ⁃3′，下 游 ：5′⁃CTAAGT⁃CATAGTCCGCCTAGAAGCA⁃3′，扩增片段 186 bp。引物由上海生物工程有限公司合成。

1.3 标本收集及处理 肝素抗凝管分别收集符合要求的骨髓标本3～5 mL，先加3 mL人外周血淋巴细胞分离液至15 mL离心管内，再将等量的骨髓液沿管壁缓慢移至分离液之液面上，500×g离心25 min，取其上清液用于ELISA，提取中间单个核细胞层总RNA用于实时荧光定量聚合酶链反应（qRT⁃PCR）。

1.4 研究方法 ELISA定量检测RhoA、ROCK1的蛋白表达，实验步骤严格按照ELISA操作说明书进行，每个标本做3个复孔，结果取均值。qRT⁃PCR检测骨髓单个核细胞RhoA、ROCK1的mRNA表达：（1）Trizol试剂提取单个核细胞总RNA；（2）cDNA第一链合成试剂盒将RNA反转录为cDNA；（3）SYBR GReen试剂盒（FP205）进行PCR扩增。PCR反应条件：总反应体系20 μL，95 ℃ 15 min（预变性）、95℃ 5 s（变性）、60℃ 20 s（退火）、72℃30 s（延伸），共40个循环。以β⁃actin表达量作为内参，用2-△△Ct值表示mRNA的相对表达量。每个标本做3个复孔，结果取均值。

1.5 统计学方法 采用SPSS 20.0处理数据，计量资料以x±s表示，计数资料及等级资料以中位数M（min，max）表示，两参数的均数比较采用t检验或方差分析。两因素相关分析计量资料采用pearson相关分析，等级资料采用Spearman分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 骨髓RhoA、ROCK1表达水平 实验组中RhoA和ROCK1蛋白与mRNA表达水平高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 RhoA、ROCK1的mRNA相对表达量及蛋白表达水平Tab.1 Relative expression of mRNA and protein expression levels of RhoA and ROCK1x±s

2.2 RhoA、ROCK1表达水平与骨质破坏程度关系 将骨质破坏程度分为早期（1、2级）、晚期（3级），其中早期骨质破坏较轻，晚期骨质破坏较重。方差分析表明骨质破坏轻度组（1、2级）和严重组（3级）的RhoA蛋白与mRNA水平均高于对照组，且严重组的RhoA蛋白与mRNA水平均高于骨质破坏轻度组（均P＜0.05）。骨质破坏严重组的ROCK1蛋白与mRNA水平均高于对照组（P＜0.05）；事后经LSD检验发现骨质破坏严重组ROCK1的mRNA水平高于骨质破坏轻度组（P＜0.05），而蛋白的表达水平在两组间差异无统计学意义（P＞0.05）；骨质破坏轻度组的ROCK1蛋白与mRNA水平与对照组相比有升高趋势，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2和图1。

表2 不同程度骨质破坏组中RhoA、ROCK1 mRNA相对表达量及蛋白表达水平Tab.2 Relative expression of mRNA and protein expression levels of RhoA and ROCK1 in different degrees of bone destruction x±s

图1 不同程度骨质破坏组中RhoA、ROCK1 mRNA相对表达量及蛋白表达水平Fig.1 Relative expression of mRNA and protein expression levels of RhoA and ROCK1 in different degrees of bone destruction

2.3 RhoA和ROCK1的蛋白表达水平与MBD患者临床参数的相关性 用Pearson与Spearman相关分析表明RhoA的蛋白表达水平与αCa、β2⁃微球蛋白（β2⁃microglobulin，β2⁃mg）、骨质损害分级、ISS分期、D⁃S分期呈正相关，而与血红蛋白（hemoglo⁃bin，Hb）呈负相关；ROCK1与αCa、β2⁃mg、骨质损害分级呈正相关，而与Hb呈负相关。见表3。

3 讨论

目前研究发现RhoA/ROCK1在乳腺癌、肝癌、胃癌等恶性肿瘤中被激活后呈高表达状态，并与肿瘤的生物学行为密切相关［9-10］。TAKESHITA等［11］在鼠的关节炎模型中发现RhoA/ROCK信号通路可改变关节软骨的细胞骨架，从而导致关节软骨细胞退变，而RhoA/ROCK信号通路的抑制剂可延缓关节炎的发生及缓解疼痛，这提示RhoA/ROCK1可能在MBD的发生、发展中有着重要的作用。

本研究通过提取MM患者骨髓上清液及单个核细胞中RhoA、ROCK1的蛋白与mRNA，发现其表达水平高于对照组，这可能说明在MM中骨髓瘤细胞促进RhoA、ROCK1的分泌而呈高表达状态。其机制可能是在MM中，瘤细胞分泌的细胞因子如白介素⁃6、MIP⁃1a、sclerostin、RANK/RANKL等促进RhoA、ROCK1的分泌，有文献报道在鼠源性骨髓瘤中瘤细胞分泌的MIP⁃1α可促使小分子G蛋白Ras和Rho异戊稀化，从而导致骨髓瘤患者骨髓中的RhoA水平增高［4，12-14］，增高的RhoA与骨髓微环境中GTP酶结合而激活下游ROCK基因，并介导ROCK的下游底物如肌球蛋白轻链磷酸酶、磷酸肌醇 3-激酶等磷酸化而促进肿瘤细胞增殖［13，15］，从而形成恶性循环，这也说明RhoA、ROCK1能反映瘤负荷水平。从临床相关资料中发现RhoA与ISS分期、D⁃S分期、β2⁃mg呈正相关，ROCK1与β2⁃mg呈正相关。而ISS分期、D⁃S分期及β2⁃MG可很好地反映MM患者的瘤负荷水平。其机制可能是瘤细胞分泌的RhoA是通过羧基端与ROCK1紧密结合，ROCK1抑制细胞外信号调节激酶1/2（extracel⁃lular signal⁃regulated kinase，Erk1/2）释放，而Erk1/2的作用底物是Bax，Erk1/2抑制后下调Bax，抑制Erk1/2/Bax/Caspase信号通路，导致瘤细胞凋亡受阻，瘤负荷增加［9，13，16］。

表3 RhoA、ROCK1的蛋白水平与MBD患者临床参数的相关性分析Tab.3 Correlation analysis between protein levels of RhoA and ROCK1 and clinical parameters of patients with MBD

本研究发现实验组的MM患者RhoA蛋白与mRNA水平均高于对照组，骨质破坏严重组中RhoA蛋白与mRNA水平高于骨质破坏轻组，骨质破坏严重组的MM患者ROCK1 mRNA水平高于骨质破坏轻组，骨质破坏轻组的MM患者ROCK1蛋白与mRNA水平均高于对照组，这些结果提示RhoA、ROCK1与骨质破坏严重程度相关，参与了MBD的发生及发展。临床相关资料也表明RhoA、ROCK1与aCa、骨质损害分级呈正相关，而αCa、骨质损害分级主要反映骨质破坏情况，提示骨质破坏越严重，RhoA、ROCK1表达水平越高，这与乳腺癌骨转移等报道一致［17］，当骨质破坏愈严重，破骨细胞因子如MIP⁃1a及RANK/RANKL增加，刺激瘤细胞增殖从而分泌更多的RhoA，RhoA参与细胞功能需通过与其下游效应蛋白ROCK1的相互作用来实现［3-4，6］。ROCK1 蛋白质序列中含有Erk结合结构域，在MBD患者中，活化的ROCK1通过蛋白序列中Erk结合结构域结合Erk1/2，ROCK1又通过羧基端与细胞膜上的RhoA结合，ROCK磷酸化后激活磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路，随后不仅诱导瘤细胞增殖、迁移、黏附、瘤细胞耐药，而且能诱导破骨细胞分化、成熟、增加破骨细胞的数量和功能，导致溶骨性破坏［16，18-19］。值得一提的是骨质破坏轻度组的MM患者ROCK1蛋白与mRNA水平较对照组相比有升高的趋势，在骨质破坏严重组的MM患者ROCK1蛋白水平较破坏轻组也有相同的趋势，但无明显统计学差异。这可能与以下原因有关：（1）MM患者的骨质可能未达到骨质疏松或破坏不明显；（2）下游ROCK1因子可能尚未完全活化；（3）研究样本数量少。

本研究还发现RhoA、ROCK1与Hb呈负相关，由于Hb是反映患者体能状态的常用指标之一，本身瘤细胞浸润骨髓、血黏度升高、反复感染、促红细胞生成素减少等可直接抑制造血干细胞造血，而增殖的瘤细胞大量分泌RhoA、ROCK及高瘤负荷水平可间接抑制造血功能，从而导致患者贫血［20］。

综上所述：RhoA/ROCK1在MM患者中呈高表达状态，骨质破坏越严重，其在骨髓中的表达水平越高，并与骨质破坏程度和aCa、β2⁃mg、ISS分期等相关，这提示RhoA/ROCK1可能在MM的发生发展中发挥重要作用，但其具体高表达机制有待下一步深入研究，以便为MBD的临床治疗提供新思路。