过表达CsMADSs拟南芥的表型变化及CsMADSs表达水平

安玉兰，翟克清，杨 峰，雷 玥，胡克玲，甘德芳，汪承刚

(安徽农业大学 园艺学院，安徽省园艺作物育种工程实验室，安徽 合肥 230036)

黄瓜(CucumissativusL.)是葫芦科一年生攀援草本植物，是夏季主要蔬菜之一，全国各地均有栽培。MADS-box家族基因是一类编码转录因子的基因，在植物生长发育过程中起重要的调控作用。研究表明，MADS-box家族基因在植物根的营养吸收、分生组织分化、春化、开花时间[1]、胚的发育及果实成熟[2]等方面发挥着重要作用[3-5]。其中，研究较多的是MADS-box基因参与花器官及果实的发育[6-8]。如过量表达BrAGL20基因能促进油菜提早开花[9]；刘励蔚等[10]采用花粉管通道法将白桦花发育基因BmMADS3导入玉米自交系中，能使玉米花期提前，与产量相关的性状如穗重、穗长、穗粗和百粒重等均显著提高；位伟强等[11]从洛阳红牡丹花芽中克隆得到1个开花调控转录因子基因PsFUL1，其在牡丹花芽和花瓣中表达量最高，在其他器官中表达水平较低或不表达。拟南芥的MADS-box基因有100多个，其在花器官的发育中发挥着重要作用[12]，但超过80%的MADS-box基因功能是未知的[13]。因此，越来越多的研究人员开始关注MADS-box基因在花器官发育以外的功能。近年来，已发现MADS-box基因在植物花色素苷合成[14]、抗逆性[15-16]、根结构、芽休眠[17]、叶片发育方面都发挥着重要的作用。番茄AGAMOUS-LIKE1基因参与番茄果皮的形成，沉默TAGL1基因会明显降低番茄果皮厚度和硬度[18]。Yu等[19]认为AGL21能够促进拟南芥侧根的伸长，从而调控侧根发育。葡萄MADS-box家族的FUL同源基因(AP1及VFUL-L)能促进葡萄卷须的分化与发育[20-21]。SLMBP11(AGL15亚家族成员)能显著降低番茄的株高、叶面积、节间长度，增加叶腋的分枝数、节点和叶片数[22]。目前，有关黄瓜MADS-box家族基因的研究较少，主要集中在调控黄瓜花器和果实发育方面。龚霞峰[23]研究表明，抑制黄瓜CUM1基因(AGAMOUS同源基因)的表达会延迟黄瓜开花，而过表达CUM1会使黄瓜花的雄蕊退化，推测CUM1基因可能参与黄瓜雄蕊和心皮的发育。过表达ERAF17基因(受乙烯诱导表达的控制植物花器发育的MADS-box基因)的黄瓜植株只产生雄花，没有雌花生成[24]。王鑫[25]以EMS诱变得到的黄瓜花器和果实发育的突变体为材料，结合高通量测序分析，定位了1个黄瓜花发育相关的基因CsSEP2(Csa4G126990)。课题组前期研究表明，黄瓜CsMADS08(Csa4G126480.1)基因在各器官都有表达，而CsMADS21(Csa6G367090.1)主要在叶、花及幼果中表达[26-27]，但CsMADSs基因的生物学功能仍然未知。本研究构建黄瓜CsMADSs(CsMADS08和CsMADS21)基因的真核表达载体，通过农杆菌介导转化烟草，利用荧光共聚焦显微镜检测CsMADSs基因在烟草细胞中的定位；同时通过花序侵染转化拟南芥，检测转基因后代拟南芥的表型变化，并研究CsMADSs在过表达拟南芥植株中的表达情况，为进一步探讨黄瓜CsMADSs基因的功能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

津绿1号黄瓜(天津市绿丰园艺新技术开发有限公司)购自合肥先锋种业，拟南芥、烟草种子、pCAMBIA1305载体与P19菌株由安徽农业大学生命科学学院作物生物学重点实验室提供。大肠埃希菌JM109感受态细胞、农杆菌感受态细胞、凝胶回收试剂盒、植物基因组DNA提取试剂盒及质粒提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。限制性内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其他试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CsMADSs基因克隆

采用Trizol试剂法提取黄瓜叶片总RNA，反转录成cDNA。用引物P1/P2和P3/P4(表1)分别扩增CsMADS08和CsMADS21序列，回收目的片段。连接pMD19-T载体，转化大肠埃希菌JM109感受态细胞，提取质粒进行酶切验证，取阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

表1CsMADSs、Gus及Hyg基因扩增的引物序列及其参数

Table1Primer sequences and parameters ofCsMADSs，GusandHyg

引物Primer引物序列Primer sequence作用FunctionP1P2P3P4Hyg-FHyg-RGUS-FGUS-RMADS08-FMADS08-RMADS21-FMADS21-RActin-FActin-RCCA-GGATCC-ATGGGAAGAGGGAGAGTTCAGCCCCCC-GTCGAC-TTACCCAAATGATAAAGAAGGGAGGG-GGATCC-ATGGGAAGAGGTAGGGTTCAAGGCG-GTCGAC-TTACCCAATGTTTAGAGAGGGATGCTTCTGCGGGCGATTTGTGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCGCGAAGTCTTTATACCGAAAGGTTGGCCCTTCACTGCCACTGACCGAGAATAGGCAGCTAGCGAAG-AAAGAAGGGATTGGTGGTGGAGAACAATGTCCAACTGGCAGGAGGTGGTGGGAATAAGAGCACCAAGCAGCATGAAGAGAACCACCGATCCAGACACT扩增CsMADS08基因For CsMADS08 gene amplification扩增CsMADS21基因For CsMADS21 gene amplification扩增Hyg基因特异片段For Hyg fragment amplification扩增Gus基因特异片段For Gus gene fragment amplificationCsMADS08基因荧光定量引物Fluorescence quantitative primers for CsMADS08CsMADS21基因片段荧光定量引物Fluorescence quantitative primers for CsMADS21Actin2基因荧光定量引物Fluorescence quantitative primers for Actin2

1.2.2 过表达载体构建及农杆菌遗传转化

利用BglⅡ、SalⅠ双酶切pCAMBIA1305-GFP载体[28]，回收大片段；利用BamHⅠ、SalⅠ双酶切质粒pMD19-T-CsMADSs，回收小片段CsMADSs。采用T4连接酶连接过夜，连接液转化大肠埃希菌JM109，经筛选获得重组质粒pCAMBIA1305-CsMADS08及pCAMBIA1305-CsMADS21。冻融法转化农杆菌EHA105。挑取农杆菌单克隆提取质粒，并进行PCR验证。挑选阳性克隆摇菌，-70 ℃冰箱保存，用于瞬时转化烟草和侵染拟南芥。

1.2.3 亚细胞定位

取pCAMBIA1305-CsMADSs农杆菌菌液及P19菌株分别摇菌，并按比例混合菌液，离心10 min，收集菌体。加入2 mL处理液(0.5 mol·L-1MES 200 μL，1 mol·L-1MgCl2100 μL，100 mmol·L-1乙酰丁酮10 μL，加水至10 mL)，吹打混匀，然后注射6叶期的烟草叶片，湿润避光环境下培养36～48 h。取烟草幼叶，切割成0.5 cm × 0.5 cm，平铺在载玻片上，加几滴蒸馏水盖好盖玻片并轻压片，置于共聚焦显微镜下扫描拍摄(激发光波长488 nm，发射光波长520～550 nm)，观察GFP在烟草叶片细胞的分布。

1.2.4 拟南芥种植及侵染

营养土和蛭石按体积比1∶3混匀装盆，播种拟南芥，待其抽薹开花后进行侵染。

取100 μL农杆菌菌液，加入45 mL的YEP培养基，培养至D值为0.8。4 ℃ 4 000 r·min-1离心10 min，取菌体加入Buffer(MS 0.11 g，蔗糖2.5 g，MES 0.025 g溶于50 mL纯水，调节pH值至5.7，加入15 μL表面活化剂Silwet-77，磁力搅拌30 min。)吹打混匀，侵染拟南芥花序，并套袋，共侵染2～3次。待种子成熟进行采收(T1代)，置于37 ℃烘干，4 ℃保存。

1.2.5 转基因拟南芥的筛选及表型观测

称取30 mg T1代种子，75%乙醇消毒1 min，再用灭菌水清洗3次，然后用0.1%灭菌琼脂糖悬浮种子，均匀平铺于含30 mg·L-1潮霉素的MS培养基上。以野生型为对照。待植株长到6片叶时，将长势强的抗性植株移栽到盆中。7 d后，利用DNA提取试剂盒提取叶片基因组DNA，PCR扩增潮霉素抗性基因Hyg、Gus报告基因及目的基因CsMADS08和CsMADS21。经检测呈阳性的植株按单株收获种子(T2代)，其余后代按同样方式筛选种植直至获得纯合植株，观察和鉴定各世代植株的表型。

1.2.6 转基因拟南芥CsMADSs的表达分析

采用Trizol法提取T3代转基因拟南芥及野生型拟南芥花期各器官(根、茎、叶、花)的总RNA，用微量核酸测定仪(ND2000)及琼脂糖凝胶电泳检测RNA的纯度及浓度。用反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser除去基因组DNA，并进行反转录反应。实时荧光定量PCR反应按照SYBR Premix ExTaqⅡ (宝生物染料法荧光定量试剂盒)说明书进行。反应体系如下：SYBR Green Master mix 12.5 μL，上游引物(10 μmol·L-1)1.0 μL，下游引物(10 μmol·L-1)1.0 μL，cDNA原液0.9 μg，加RNase free H2O至25 μL。以拟南芥Actin2(AT3G18780)基因为内参，引物序列见表1。实时荧光定量PCR反应条件为：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。每个试样重复4次，以非转化株为对照。qPCR结果采用2-ΔΔCt法计算。

2 结果与分析

2.1 基因克隆及载体构建

提取黄瓜叶片总RNA，经反转录成cDNA，分别以P1/P2和P3/P4为引物，扩增得到约650 bp的片段，回收目的片段，连接pMD19-T载体，经测序得到的CsMADS08和CsMADS21长度分别为633 bp和645 bp。利用BamHⅠ、SalⅠ双酶切质粒pMD19-T-CsMADSs，连接到经BglⅡ、SalⅠ双酶切的pCAMBIA1305载体中，转化农杆菌EHA105，提取质粒进行PCR验证。结果(图1)表明，目的基因已经成功连接到pCAMBIA1305载体中。

M，DL 2 000 DNA marker; A，CsMADS08; B，CsMADS21.图1 重组质粒pCAMBIA1305-CsMADSs的PCR验证Fig.1 PCR amplification of recombinant plasmid pCAMBIA1305-CsMADSs

2.2 烟草亚细胞定位

利用激光共聚焦显微镜观测CsMADSs在烟草叶片细胞中的定位情况。结果(图2)显示，CsMADS08定位于细胞膜和细胞核上(图2-A)，CsMADS21定位于细胞膜上(图2-B)，对照pCAMBIA1305空载体定位于细胞膜和细胞核上(图2-C)。

2.3 过表达拟南芥植株阳性株的筛选

取T1代拟南芥种子，经消毒后平铺于含30 mg·L-1潮霉素的MS培养基中，以野生型为对照。结果发现，野生型植株均出现黄化直至死亡，大部分T1代植株表现出与野生型相似的表型，只有少数植株生长正常。将生长健壮的植株移栽于营养钵中，精细管理，供后续检测。

A，CsMADS08；B，CsMADS21；C，pCAMBIA1305载体；D～F，烟草叶片明场对照图。A，CsMADS08; B，CsMADS21; C，pCAMBIA1305 vector; D-F, Contrast picture of tabacco leaves in open field.图2 CsMADSs基因在烟草叶片的亚细胞定位Fig.2 Subcellular localization of CsMADSs in tobacco leaf

提取潮霉素抗性植株的叶片DNA，PCR分别扩增潮霉素抗性基因和Gus基因。其中，转CsMADS08基因的抗性植株，利用潮霉素抗性基因及CsMADS08基因进行PCR检测，结果显示有目的条带(图3-A，3-C)。转CsMADS21的抗性植株，利用潮霉素抗性基因、CsMADS21及Gus报告基因进行PCR检测，分别得到相应的扩增条带(图3-B，3-C，3-D)。

2.4 过表达拟南芥植株后代的表型变化

在T2、T3代转基因拟南芥植株中，过表达CsMADS21的拟南芥植株，主茎的花序发育比野生型早5～6 d(图4-A)；同时植株叶片颜色加深，呈紫色(图4-B)，且侧枝数增加，侧生花序及果荚数都较野生型多(图4-D)。而过表达CsMADS08的拟南芥植株，幼苗期出现大量的莲座叶，同时侧枝上出现大量莲座状丛生叶片(图4-C)，甚至果荚成熟后，依然有新的莲座状的茎生叶抽出(图4-E)，侧枝数减少，果荚数减少(图4-D)；植株也出现叶片颜色加深，呈紫色。提取过表达转基因拟南芥及野生型拟南芥叶片的花青素，结果显示，过表达植株叶片的花青素含量均比野生型高，达到显著差异(结果未列出)。

与野生型植株相比，T4代转CsMAD08的拟南芥植株出现了表型分化。一种表现为株型矮化、分枝数多，分枝细弱；另一种则出现植株莲座叶增多，茎上着生莲座状叶片，叶片多而分枝少的现象(图5)。

2.5 过表达拟南芥植株中CsMADSs的组织特异性表达

采用Trizol法提取T3代植株各器官总RNA，反转录成cDNA，实时荧光定量PCR检测CsMADS08和CsMADS21的表达情况。结果表明：过表达CsMADS08的拟南芥植株，目的基因在茎中表达量较高，在其他器官中的表达量较低(图6-A)；过表达CsMADS21的拟南芥植株，目的基因在花中表达量较高，在根、茎、叶中表达量较低(图6-B)。

A: 1～3，转CsMADS08植株的潮霉素基因扩增；4，阴性对照(非转化株)。B: 1～4，转CsMADS21植株的潮霉素基因扩增；5，阴性对照(非转化株)。C: 1，pCAMBIA1305-CsMADS08质粒的CsMADS08扩增；2，过表达拟南芥植株的CsMADS08扩增；3，阴性对照(非转化株)；4，pCAMBIA1305-CsMADS21质粒的CsMADS21扩增；5，过表达拟南芥植株的CsMADS21扩增。D: 1～4，转CsMADS21植株的Gus基因扩增；5，阴性对照(非转化株)。A: 1-3，Hyg gene amplification of CsMADS08 transgenic plants; 4，Negative control (non-transgenic plants). B: 1-4，Hyg gene amplification of CsMADS21 transgenic plants; 5，Negative control (non-transgenic plants). C: 1，Amplification of CsMADS08 in pCAMBIA1305-CsMADS08 plasmids; 2，Amplification of CsMADS08 in CsMADS08 transgenic plants; 3，Negative control (non-transgenic plants); 4，Amplification of CsMADS21 in pCAMBIA1305-CsMADS21 plasmids; 5，Amplification of CsMADS21 in CsMADS21 transgenic plants. D: 1-4，Gus gene amplification of CsMADS21 transgenic plants; 5，Negative control (non-transgenic plants).图3 转基因拟南芥植株的PCR电泳图Fig.3 Electrophoresis map of Arabidopsis transgenic plants

A：野生型拟南芥(左)，转CsMADS21拟南芥(右)；B：上为过表达拟南芥植株呈紫色，下为野生型拟南芥；C：过表达CsMADS08拟南芥的莲座状茎生叶；D：左为野生型，中为过表达CsMADS21拟南芥，右为过表达CsMADS08拟南芥；E：左为野生型，右为过表达CsMADS08拟南芥的茎生叶。A: Wild type in left，CsMADS21 transgenic plants in right; B: CsMADS21 transgenic plants on the top and wild type are below; C: Cauline leaves of CsMADS08 transgenic plants; D: Wild type in left，CsMADS21 transgenic plants in middle，CsMADS08 transgenic plants in right; E: Wild type in left，cauline leaves of CsMADS08 transgenic plants in right.图4 转基因拟南芥植株的表型变化Fig.4 Phenotypic variation of Arabidopsis transgenic plants

左：野生型拟南芥；中和右：转CsMADS08拟南芥。Left，Wild type; Middle and right，CsMADS08 transgenic plants.图5 T4代转CsMADS08拟南芥的表型分离Fig.5 Phenotypic segregation of T4 CsMADS08 Arabidopsis transgenic plants

3 讨论

3.1 过表达CsMADSs拟南芥植株的表型变化及分离

过表达CsMADS08的拟南芥植株，主茎刚抽出时，其莲座叶数目增加，茎生叶也呈现丛生状。花序抽生时，侧枝数目少，果荚较野生型瘦弱，株型较矮。在生长后期，侧枝上出现大量的莲座状叶片，侧枝果荚数目少，果荚较短，较瘦瘪。在野生型植株完全成熟后，同期过表达CsMADS08的拟南芥植株侧枝上还会有新的莲座叶出现。过表达CsMADS08的T4代植株表型出现了分化，一种株型矮化、分枝多，枝条细弱，而另一种则表现为莲座叶数目增多而分枝减少。说明CsMADS08基因可能参与调控植株腋芽的分化方向，分化形成更多的叶片；由于植株不断产生莲座状叶片，致使营养流向新生的幼叶，造成植株分枝数减少，开花和结荚数也相应减少，果实得不到足够的养分供应，所以果实瘦弱干瘪。该研究结果与Guo等[22]的结果相似，其研究结果表明番茄MADS-box基因SLMBP11(AGL15亚家族的成员)能显著降低株高、叶面积、节间长度，而叶腋的分枝数、节点和叶片数都增加，推测该基因可能调控腋芽的生长。黄瓜CsMADS08基因如何调控腋芽的生长还有待进一步验证。相反，过表达CsMADS21的拟南芥植株，其主茎开花结果比野生型早5～6 d，侧枝数目增加，花序较多，结荚率高，果荚饱满。说明CsMADS21可能参与花芽的分化、形成及果实的发育，相关的后续研究正在进行。前期研究结果表明，黄瓜CsMADS08及CsMADS21属于AP1-FUL类的MADS-box基因，而且与拟南芥的AtAGL7、AtAGL8及AtAGL79具有较高的同源性[23]。有报道认为，AGL8在拟南芥的果实发育及叶片形状方面起调控作用[29]，黄瓜CsMADS21的结果与此相似，但CsMADS08的结果与此不同。AtAGL7及AtAGL79对拟南芥生长发育的影响尚未见报道。褚婷婷等[30]研究了拟南芥AP1-FUL类基因的表达调控模式，发现FUL启动子的上游存在2个抑制其表达的顺式作用元件，且FUL基因的第1个内含子参与拟南芥心皮核雄蕊的发育调控。

图6 过表达拟南芥植株CsMADSs基因的表达Fig.6 Expression analysis of CsMADSs in Arabidopsis transgenic plants

3.2 过表达拟南芥植株CsMADSs基因的表达量变化

MADS-box作为一类重要的转录调控因子，参与植物许多重要的生物学过程，尤其在花及果实的发育成熟过程中起重要作用。Yin等[31]研究了SIMBP8基因在番茄各器官的表达情况，发现其在番茄的老叶、萼片及后期的果实中高表达，进一步研究发现，SIMBP8干涉转基因植株的果实能产生较高的乙烯，其成熟时间比野生型提前2～4 d，说明SIMBP8对番茄果实后熟软化起重要作用。本试验中，过表达CsMADS08的拟南芥植株，目的基因在茎中有较高的表达量，在其他器官中表达量较低，这可能与CsMADS08参与控制腋芽的分化以及莲座叶的形成相关，这与Guo等[22]的研究结果类似。CsMADS08对茎或侧枝的生长可能起着负调控作用，促使腋芽分化形成更多的叶片，导致植株的营养大多流向新生的叶片，造成植株分枝少、结荚少。而过表达CsMADS21的拟南芥植株，目的基因在花中有较高的表达量，而在根、茎、叶中表达量较低，该结果与之前各世代在表型上的特征相一致，花期提前、花序多、结荚率高及果荚饱满等，进一步说明CsMADS21可能参与花的分化及果实的发育。至于CsMADS08和CsMADS21在黄瓜生长发育过程中的调控作用还有待于进一步研究。