不同水温下盐酸氯苯胍在斑点叉尾血浆的药代动力学研究

余琳雪，刘永涛，苏志俊，丁 浩，艾晓辉，*

(1.水产科学国家级实验教学示范中心(上海海洋大学)，上海 201306； 2.中国水产科学研究院 长江水产研究所，湖北 武汉430223； 3.农业农村部水产品质量安全控制重点实验室，湖北 武汉430223)

1 材料与方法

1.1 试验动物

1.2 药品与试剂及配制方法

盐酸氯苯胍(纯度≥98%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司)，氘代盐酸氯苯胍标准品(纯度≥98%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司)，盐酸氯苯胍原料药(纯度98%，寿光市华弛化工有限公司)。乙腈，乙酸，乙酸乙酯，正己烷，甲酸(色谱纯，美国J.T. Baker公司)。无水乙醇(分析纯，西陇化工股份有限公司)，蒸馏水，可溶性淀粉(分析纯，湘中化学试剂供应站)，无水硫酸镁(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，肝素钠(生物级，上海生化试剂有限公司)。

1.2.1 灌胃液的配制

称取0.5 g盐酸氯苯胍，用10 mL乙醇溶解，加2 g淀粉，并用蒸馏水定容至100 mL，制备成浓度为5 mg·mL-1的悬浊液。灌胃前用磁力搅拌器使悬浊液混匀。

1.2.2 标准储备液的配制

分别准确称取10 mg的盐酸氯苯胍标准品和氘代盐酸氯苯胍标准品，置于100 mL容量瓶中，分别加少量甲醇溶解并定容至100 mL，配制成100 mg·L-1的盐酸氯苯胍和氘代盐酸氯苯胍标准储备液，-20 ℃保存备用。

1.2.3 肝素钠溶液的制备

称取0.5 g肝素钠溶解在50 mL蒸馏水中配成1%的肝素钠溶液。

1.3 仪器与色谱条件

自动高速冷冻离心机(日本HITACHI 20PR-520 型)；Mettler-Toledo AE-240 型精密电子天平(梅特勒-托利多公司)；调速混匀器(上海康华生化仪器制造厂)；磁力搅拌器(MS-PA 美国SCILOGEX)；氮吹仪(AOSHENG，杭州奥盛仪器有限公司)；高效液相色谱-串联质谱(SURYEYOR MS PUMP PLUS，SURYEYOR AUTOSAMPLER PLUS，Thermo TSQ QUANTUM ACESS MAX及Thermo LCquan 2. 6 数据采集处理软件)。

色谱柱：Symmetry®C18(100 mm×2.1 mm×3.5 μm)色谱柱；流速为250 μL·min-1；进样量20.0 μL；柱温30 ℃。梯度洗脱条件见表1，A相为0.1%甲酸水溶液，B相为甲醇。

1.4 质谱分析条件

采用加热电喷雾离子源(HESI)，负离子模式；检测方式采用选择反应监测(SRM)模式；喷雾电压-3 000 V；鞘气压力40 kPa；辅助气压力5 kPa；蒸发气温度350 ℃；碰撞气氩气，压力1.5 MPa；离子传输毛细管温度350 ℃。母离子，定性离子对，定量离子对和碰撞能量见表2。

表1流动相梯度洗脱程序

Table 1 Mobile phase gradient elution program %

A，0.1%甲酸水溶液；B，甲醇。

A，0.1% Formic acid aqueous solution; B，Methanol.

1.5 给药方式及样品采集

1.6 样品处理

将血浆样品在室温下解冻后，摇匀，准确吸取1.0 mL于10 mL离心管中，加入50 μL 1 μg·mL-1内标溶液氘代盐酸氯苯胍，加入5 mL 1%甲酸乙酸乙酯溶液，置调速混匀器上涡旋振荡30 s，超声5 min，再加入0.5 g无水硫酸镁，涡旋振荡30 s，7 104g离心5 min，将上清液转移到另一支10 mL离心管中，再向溶液中加入3 mL 1%甲酸乙酸乙酯溶液，涡旋振荡30 s，7 104g离心5 min，合并两次上清液于10 mL离心管中，置45 ℃氮吹仪上吹至干，用1 mL定容溶液(A、B体积比30∶70)溶解残渣，涡旋振荡30 s，15 984g离心5 min，0.22 μm微孔滤膜过滤后上机检测。

1.7 标准曲线制备及回收率与精密度测定

标准曲线制备：以标准储备液为基础，配制含氘代盐酸氯苯胍内标50 ng·mL-1，盐酸氯苯胍浓度为0.01、0.05、0.2、0.5、2，5、10、20 μg·mL-1的标准曲线，作HPLC-MS分析。以测得的盐酸氯苯胍和氘代盐酸氯苯胍的峰面积比值为纵坐标，盐酸氯苯胍的浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数。

表2盐酸氯苯胍和氘代盐酸氯苯胍质谱条件

Table2Mass spectrometry parameters of ROBH and ROBH-D8

药物Drug母离子Parention子离子Production碰撞能量Collision energy/VROBH331.9152.924194.9*17ROBH-D8339.9156.926198.9*16

*，离子对为定性离子对。

*，Qualitative ion pair.

回收率与精密度测定：在空白血浆中分别添加4个浓度水平的标准溶液，使血浆中盐酸氯苯胍质量浓度分别为1、10、50、100 ng·mL-1，氘代盐酸氯苯胍的质量浓度为50 ng·mL-1。每个浓度样品，日内做5个重复，一周内重复做5次，计算日内及日间精密度。

1.8 数据处理

标准曲线，药-时曲线图采用Microsoft Excel 2013软件绘制；药物动力学模型拟合及参数计算采用中国药理学会数学专业委员会编制的3p97药代动力学程序软件处理。

2 结果与分析

2.1 色谱特征和标准曲线

在1～20 μg·mL-1浓度范围内盐酸氯苯胍线性关系良好，线性方程为y=0.010 7x+0.019 1，决定系数R2=0.999 1。

在本试验建立的色谱条件下，基线走动平稳，盐酸氯苯胍峰形良好，无明显杂质峰影响，色谱图见图1。盐酸氯苯胍的出峰时间为5.69 min，氘代盐酸氯苯胍的出峰时间为5.68 min，样品的分析时间为9 min。

2.2 回收率、准确度及精密度考查

以1、10、50和100 ng·mL-14个添加浓度测定血浆样品中盐酸氯苯胍的平均回收率，分别为(89.43±2.88)%、(88.07±2.57)%、(116.45±1.17)%和(95.22±1.51)%，日内变异系数为3.8%、7.19%、1.09%和4.49%，日间变异系数4.19%、11.68%、5.88%和6.74%。按3倍信噪比计算血浆中盐酸氯苯胍检测限为0.5 ng·mL-1，定量限为1 ng·mL-1。

图1 50 ng·mL-1盐酸氯苯胍与盐酸氯苯胍-D8标准溶液溶液SRM色谱图(左)和空白血浆加标50 ng·mL-1盐酸氯苯胍与盐酸氯苯胍-D8 SRM色谱图(右)Fig.1 SRM chromatogram of 50 ng·mL-1 ROBH and ROBH-D8 standard solution (left) and SRM chromatogram of blank plasma adding 50 ng·mL-1 ROBH and ROBH-D8 (right)

2.3 不同水温下盐酸氯苯胍在斑点叉尾血浆中药物浓度的变化

2.4 不同水温下盐酸氯苯胍在斑点叉尾血浆中药代动力学特征

图2 18 ℃和28 ℃水温条件下盐酸氯苯胍在斑点叉尾体内的药时曲线Fig.2 Concentration-time curve of ROBH in channel catfish plasma at 18 ℃ and 28 ℃

2.5 不同水温下盐酸氯苯胍在斑点叉尾血浆的药动学参数

采用3p97实用药代动力学软件对血浆中药物浓度-时间的数据进行拟合，结果表明，盐酸氯苯胍在血浆中的药动学符合二室模型，其主要参数见表3。由表3可以看出，当水温升高时，吸收速率(ka)、分布速率(α)和消除速率(β)均较快，吸收半衰期[T1/2(ka)]、分布半衰期[T1/2(α)]和消除半衰期[T1/2(β)]均缩短。而且28 ℃条件下其达峰时间(Tpeak)和药时曲线下面积(AUC)也低于18 ℃条件下。

Table3Pharmacokinetic parameters for ROBH following single oral administration of 20 mg·kg-1at 18 ℃ and 28 ℃

参数Parameters18 ℃28 ℃A/(μg·mL-1)4.177.69B/(μg·mL-1)2.480.13α/h-10.010.02β/h-10.0080.01ka/h-10.050.27T1/2(ka)/h14.672.54T1/2(α)/h64.6030.99T1/2(β)/h85.5258.63K21/h-10.0090.01K10/h-10.010.02K12/h-10.00020.0002Tpeak/h42.3610.03Cmax/(μg·mL-1)3.515.76AUC/(μg·mL-1·h)554.18326.74CL(s)/(L·h-1·kg-1)0.040.06 V/F(c)/(L·kg-1)3.792.78

A为分布相的零时截距；α为分布速率常数；B为消除相的零时截距；β为消除速率常数；ka为吸收速率常数；T1/2(α)为分布半衰期；T1/2(β)为消除半衰期；T1/2(ka)为吸收半衰期；Tpeak为达峰时间；Cmax为峰浓度；AUC为药时曲线下面积；CL为肾清除率；V/F为相对表观容积。

A，Zero intercept of distribution phase;α，Distribution rate constant;B，Zero intercept of phase elimination;β，Elimination rate constant;ka，Absorption rate constant;T1/2(α)，Distribution half-life;T1/2(β)，Elimination half-life;T1/2(ka)，Absorption half-life;Tpeak，Time at highest peak of concentration;Cmax，The biggest concentration of the drug in plasma; AUC，Area under concentration-time curve; CL，The overall clearance rate;V/F，Apparent volume of distribution.

3 讨论

3.1 盐酸氯苯胍在斑点叉尾血浆中的药-时曲线特征

3.2 盐酸氯苯胍在斑点叉尾体内的药动学特征