两种芦笋不同部位酚类物质及抗氧化活性研究

尹培培，杨灵光，王桂宏，3，赵福江，4，贾爱荣，赵鲁豫，刘永，刘昌衡，*

（1.齐鲁工业大学（山东省科学院）生物研究所，山东济南250103；2.北京林业大学生物科学与技术学院，北京100083；3.烟台大境生态环境科技股份有限公司，山东烟台264003；4.山东极贝尔生物科技有限公司，山东济南250014；5.菏泽巨鑫源食品有限公司，山东菏泽274400）

芦笋（Asparagus officinalis L.）又名石刁柏、龙须菜，为百合科天门冬属多年生草本植物[1]。其嫩茎鲜美芳香，富含有蛋白质、脂肪、碳水化合物、胡萝卜素、尼克酸、维生素、多种微量元素、酞胺及盐类等多种营养成分，并能够促进消化增进食欲，具有较高的营养价值和药用价值，因此被列为世界“十大名菜”之一，素有“蔬菜大王”的美称[2]。除此之外，芦笋还富含以芦丁为主的黄酮等次生代谢产物[3]，因而具有抗肿瘤、降血脂、抗菌、抗氧化、调节免疫力、抗衰老、抗疲劳等活性功能[4-6]。营养学家和素食界人士均称它是健康食品和全面的抗癌食品。

芦笋品种很多，从颜色上可粗略分为绿芦笋和白芦笋两大类[7]。绿芦笋是完全光合作用的产物，而白芦笋的整个生长过程完全避光。绿芦笋中维生素、叶酸、胡萝卜素、膳食纤维、蛋白质和碳水化合物等含量比较高，白芦笋则含有比较多的微量元素、矿物质元素及比例恰当的氨基酸。然而，目前对两种芦笋中酚类成分及其抗氧化活性的研究还比较匮乏。本文对两种芦笋不同部位的总酚、总黄酮、总单宁、缩合单宁和芦丁含量，以及抗氧化活性进行比较，并对其相关性进行分析，为衡量芦笋的品质、食用与药用价值等提供科学依据，为绿芦笋和白芦笋的深度开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

绿芦笋、白芦笋：菏泽巨鑫源食品有限公司，采集新鲜的白芦笋和绿芦笋，清水洗净基部污垢，将两种芦笋均分为芦笋尖和芦笋茎两部分，得到绿芦笋尖和绿芦笋茎、白芦笋尖和白芦笋茎4组样品。立即放入105℃烘箱15 min进行灭酶，然后置于50℃烘箱干燥至恒重。采用中药粉碎机将样品粉碎，过120目筛，保存至-20℃冰箱备用。

ABTS、DPPH、6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸（水溶性维生素E，即Trolox）、福林酚溶液：美国Sigma公司；乙腈（色谱级）：美国Fisher公司；芦丁标准品：中国食品药品检定研究院；其它试剂均为分析纯级别。

5804R型台式离心机：德国艾本德；DHG-9070A型电热鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；Infinite M200 Pro型多功能酶标仪：瑞士TECAN；KQ-400KDF型超声波提取仪：江苏昆山超声仪器有限公司；LC-20A液相色谱仪：日本岛津。

1.2 试验方法

1.2.1 芦笋酚类物质的提取

准确称取每份为1.000 g的芦笋样品各3份，置于50 mL离心管中，分别加入10 mL浓度为80%的乙醇水溶液，摇匀，置于超声波提取仪中超声提取30 min，冷却至室温，过滤；残渣重复以上步骤提取两次，合并3次滤液。用乙醇水溶液定容至30 mL，此溶液用于测定分析总酚、总黄酮、总单宁和缩合单宁的含量、各种抗氧化活性及芦丁含量。

1.2.2 总酚及总单宁含量的测定

总酚含量的测定：将40 μL福林酚溶液加到96孔板中，再加入20 μL样品、空白及标准品溶液，混合均匀；室温孵育5 min，加入140 μL的Na2CO3溶液，混合均匀；置于40℃烘箱中避光孵育30 min后，于765 nm波长下检测，每个样品设置3次重复。以没食子酸浓度为横坐标（x），吸光度值（OD）为纵坐标（y），建立标准曲线。根据标准曲线计算被测样品溶液中没食子酸浓度当量，总酚含量以没食子酸当量（gallic acid equivalent，GAE）表示，结果表达为mg GAE/g干重。

总单宁含量的测定：将100mg干酪素加入到25mL待测样品溶液，于室温条件下，150 r/min振摇3 h，过0.45 μm滤膜，上清液用于总单宁的测定，测定方法同总酚。总单宁含量以没食子酸当量（GAE）表示，表达为mg GAE/g干重。

1.2.3 总黄酮含量测定

将120 μL样品、空白及标准品溶液加到96孔板中，加入8 μL亚硝酸钠溶液，混合均匀，室温孵育6 min，加入 8 μL 的 AlCl3溶液，混合均匀，室温孵育5 min，最后加入100 μL的NaOH溶液混匀，室温避光孵育30 min，用酶标仪于410 nm波长下检测，每个样品重复3次。以芦丁浓度为横坐标（x），吸光度值（OD）为纵坐标（y），建立标准曲线。根据标准曲线计算被测样品溶液中芦丁浓度当量，总黄酮含量用芦丁当量（rutin equivalent，RE）表示，表达为 mg RE/g干重。

1.2.4 缩合单宁测定

将20 μL样品、空白及标准品溶液加到96孔板中，加入120 μL 4%的香草醛甲醇溶液，混合均匀，200 r/min震荡 1 min，加入 60 μL 的浓 HCl，混合均匀，200 r/min震荡5 min，室温避光孵育15 min，用酶标仪于500 nm波长下检测，每个样品重复3次。以儿茶素标准品的浓度为横坐标（x），吸光度值（OD）为纵坐标（y），建立标准曲线。根据标准曲线读出被测样品溶液中儿茶素浓度当量，缩合单宁的含量用儿茶素当量（catechin equivalent，CE）表示，表达为 mg CE/g干重。

1.2.5 抗氧化能力测定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力

将10 μL的Trolox、样品及空白溶液加到96孔板中，加入40 μL新鲜配制的DPPH甲醇溶液，混合均匀后加入190 μL的甲醇溶液，200 r/min振摇1 min；室温避光孵育30 min。用酶标仪于517 nm波长下检测，每个样品重复3次。自由基清除活性（radical scavenging activity，RSA）/%=（AO-AS）/AO×100，AS为样品溶液吸光度值，AO为空白溶液吸光度值。根据标准曲线计算DPPH自由基清除能力。结果表示为Trolox当量（Trolox equivalent，TE）μmol/g干重。

1.2.5.2 ABST自由基清除能力

将5 μL的Trolox、样品及空白溶液加到96孔板中，再加入200 μL新鲜配制的ABTS+·工作液，室温避光孵育5 min。用酶标仪于734 nm波长下检测，每个样品重复3次。自由基清除活性RSA/%=（AO-AS）/AO×100，AS为样品溶液吸光度值，AO为空白溶液吸光度值。根据标准曲线计算ABTS自由基清除能力。结果表示为Trolox当量（Trolox equivalent，TE）μmol/g干重。

1.2.5.3 还原力

准确量取0.4 mL待测样品溶液或空白溶液，再加入 1 mL磷酸缓冲液及1 mL铁氰化钾（K3[Fe（CN）6]）溶液，混合均匀，于50℃水浴孵育20 min；再加入0.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，室温孵育10 min。取上述溶液1 mL，加入1 mL蒸馏水和0.2 mL 0.1%氯化铁溶液，均匀混合，用分光光度计于700 nm处测定吸光度值。溶液的吸光度值越高，还原力越强，反之越弱。结果表示为Trolox当量（Trolox equivalent，TE）μmol/g干重。

1.2.6 芦笋提取物的指纹图谱及芦丁含量测定

芦笋提取物的指纹图谱及芦丁含量测定的HPLC条件：色谱柱采用Eclipse XDB-C18 column（Agilent，250 mm×4.6 mm，5 μm）。流动相 A-水/甲酸（99.6 ∶0.4）和流动相B-乙腈，流速为1 mL/min；梯度洗脱程序为：0～30 min，5%B～20%B；30 min～38 min，20%B～21%B；38 min～40 min，21%B；40 min～50 min，21%B～40%B；50 min～70 min，40%B～80%B。进样体积为 10 μL，柱温箱为35°C，检测波长为280 nm。批处理时，两针之间用100%B冲洗20 min，并用起始条件稳定10 min。

1.2.7 统计学分析

结果表达为平均值±标准偏差（SD），试验至少重复3次。数据的显著性差异（t检验：等方差双尾检验）采用Microsoft Excel数据分析软件。P＜0.05差异显著，P＜0.01差异极显著。相关性分析采用Windows SPSS 17.0版本，相关系数选项选用Pearson检测。

2 结果与分析

2.1 芦笋中总酚、总黄酮、总单宁和缩合单宁的含量

2.1.1 没食子酸、芦丁和儿茶素标准曲线

为避免传统有毒有机试剂的影响，本研究采用乙醇水溶液提取芦笋中的酚类物质[8]。根据预试验结果，80%乙醇水溶液提取效果最好，提取液中酚类物质的含量最高，因此采用80%乙醇水溶液提取芦笋中的酚类物质。

为了准确测定白芦笋茎、白芦笋尖、绿芦笋茎和绿芦笋尖4个样品中总酚、总黄酮、总单宁和缩合单宁的含量，分别建立没食子酸、芦丁和儿茶素的标准曲线，见图1。

如图1所示，图1A为测定总酚和总单宁所用的没食子酸标准曲线，其线性回归方程为：y=0.005 5x+0.062 7，R2=0.999 0，表明没食子酸浓度在 0～300 μg/mL 范围内线性关系良好；图1B为测定总黄酮所用的芦丁标准曲线，其线性回归方程为：y=0.003 7x+0.049 2，R2=0.999 7，表明芦丁浓度在0～100 μg/mL范围内线性关系良好；图1C为测定缩合单宁所用的儿茶素标准曲线，其线性回归方程为：y=0.001 3x+0.060 3，R2=0.996 3，表明儿茶素在0～300 μg/mL范围内线性关系良好。

图1 测定总酚、总单宁、总黄酮和缩合单宁所建立的没食子酸、芦丁和儿茶素的标准曲线Fig.1 Standard curves of gallic acid，rutin and catechin for total phenols and tannins，flavonoids，and condensed tannins assay

2.1.2 总酚、总黄酮、总单宁和缩合单宁的含量

通过测定4个芦笋样品中的总单宁及缩合单宁含量发现：白芦笋茎、白芦笋尖、绿芦笋茎及绿芦笋尖均不含单宁及缩合单宁，这说明芦笋可食用嫩茎部分不含单宁类物质，这也是芦笋口感好、味道鲜美脆嫩的原因。白芦笋和绿芦笋两个部位总酚和总黄酮的含量见图2。

由图2可知，白芦笋和绿芦笋提取物中总酚（图2A）和总黄酮（图2B）的含量具有显著性差异。由图2A可知，白芦笋茎、白芦笋尖、绿芦笋茎和绿芦笋尖中总酚含量之间均具有显著性差异，其含量从高到低依次为：绿芦笋尖＞绿芦笋茎＞白芦笋尖＞白芦笋茎。由图2B可知，白芦笋茎和白芦笋尖之间总黄酮含量没有显著性差异，而绿芦笋茎和绿芦笋尖之间黄酮含量具有显著性差异，其含量由高到低依次为：绿芦笋尖＞绿芦笋茎＞白芦笋尖≈白芦笋茎。由此可得，绿芦笋样品（茎和尖）中总酚和总黄酮含量显著高于白芦笋样品（茎和尖），而芦笋尖的总酚和总黄酮含量高于芦笋茎。本研究采用的白芦笋和绿芦笋为同一品种，其唯一区别在于绿芦笋经过正常光合作用呈现出绿色，而白芦笋在整个生长周期里全部在地底下，避光生长所以呈现白色。在自然界中，黄酮类化合物是大多数植物体自身存在的一类最主要的抗紫外化合物，它能够有效吸收紫外线，使植物体器官组织，尤其是光合作用组织免受或少受辐射损害[9]。因此推测光照有利于芦笋中黄酮类化合物的合成，从而导致绿芦笋中总酚及总黄酮含量均高于白芦笋。

图2 白芦笋和绿芦笋两个部位总酚和总黄酮的含量Fig.2 Contents of total phenols and total flavonoids in different parts of white and green asparagus

2.2 芦笋3种抗氧化活性测定

植物中存在的酚类物质，如黄酮、酚酸及单宁等，是其发挥抗氧化活性的主要因素[10]。研究表明，不同抗氧化剂存在不同的抗氧化机制，因此单一的抗氧化方法很难全面反映包含多种化合物的植物提取物的抗氧化能力[11-12]，因此本文采用了DPPH自由基及ABTS自由基清除能力和还原力测定3种试验方法。为了准确测定各样品的DPPH自由基、ABTS自由基清除能力和还原力，Trolox标准曲线分别如图3A～3C所示：y=0.228 5x+1.014 7，R2=0.996 8；y=0.236 2x+1.867 2，R2=0.992 7；y=0.002 2x+0.045 2，R2=0.997 8，且 Trolox浓度在0～400 μg/mL范围内线性关系良好。

4种样品的DPPH自由基、ABTS自由基清除能力及还原力如图3D～3F所示，自由基的清除能力变化越快，表示物质的氢原子供给能力越强[13]。3种抗氧化结果显示，4种样品的抗氧化能力显著不同，且趋势一致：绿芦笋尖＞绿芦笋茎＞白芦笋尖＞白芦笋茎。并且，样品抗氧化能力趋势与其总酚含量趋势相同。因此，初步推测，芦笋抗氧化能力的强弱与其总酚含量有关，总酚含量越多，抗氧化能力越强，反之，抗氧化能力越弱。

图3 Trolox标准曲线及两种芦笋不同部位的DPPH、ABTS自由基清除能力和还原力Fig.3 Standard curves of Trolox and antioxidant capacity of different parts of white and green asparagus by DPPH，ABTS free radical scavenging abilities and reducing power

A.DPPH自由基Trolox标准曲线；B.ABTS自由基Trolox标准曲线；

C.还原力Trolox标准曲线；D.DPPH自由基清除能力；E.ABTS自由基清除能力；F.还原力；不同字母为差异显著P＜0.05。

2.3 芦笋提取物的指纹图谱及芦丁含量分析

为了探究芦笋提取物中酚类物质的组成差异，采用HPLC法构建白芦笋茎、白芦笋尖、绿芦笋茎及绿芦笋尖提取物的指纹图谱，并测定样品中芦丁含量。图4和图5分别为4种芦笋样品相同浓度下的HPLC指纹图谱和芦丁含量图。

图4 芦丁标样和4个芦笋样品的HPLC指纹图谱Fig.4 HPLC profiles of rutin and four asparagus samples

由图4可知，芦笋含有多种酚类物质，且芦丁含量最高，是芦笋中主要的酚类物质，这与Shou等的研究结果一致[14]；绿芦笋样品中酚类物质的种类及含量均显著高于白芦笋样品，且绿芦笋尖中酚类物质及含量最高，白芦笋茎中最低，这与4种芦笋样品中总酚及3种抗氧化趋势是一致的。由图5可知，绿芦笋尖提取物中芦丁含量最高（5.261±0.021）mg/g，其次是绿芦笋茎（1.302±0.011）mg/g、白芦笋尖（0.090±0.002）mg/g、白芦笋茎（0.025±0.001）mg/g。以上结果说明，芦笋的抗氧化能力不仅与酚类物质的含量有关，并且也与其活性物质的组成有关。

图5 HPLC法测定4种芦笋样品中芦丁含量Fig.5 HPLC was used to determine rutin contents in four asparagus samples

2.4 芦笋中总酚、总黄酮、芦丁含量及其抗氧化能力相关性分析

总酚、总黄酮、芦丁含量、DPPH自由基和ABTS自由基清除活性及还原力之间的相关性见表1。

表1 相关性分析Table 1 Correlation analyses

如表1所示，总酚、总黄酮、芦丁、DPPH自由基和ABTS自由基清除能力两两之间都显著正相关，并且总酚和DPPH自由基和ABTS自由基清除能力之间、总黄酮和芦丁之间、芦丁和DPPH自由基清除活性之间、DPPH自由基与ABTS自由基清除能力之间都极显著正相关。以上结果说明芦笋中的酚类物质是抗氧化活性的主要贡献者。此外，还原力与总酚、总黄酮、芦丁、DPPH自由基和ABTS自由基清除能力之间具有较高的相关系数，但没有显著相关性。以上结果说明，芦笋中的酚类物质与DPPH自由基、ABTS自由基清除活性密切相关。该结果与之前的报道一致，植物中的多酚、黄酮等物质的含量与其抗氧化活性相关[15-16]。因此，绿芦笋中总酚、总黄酮的含量高，其抗氧化性较强，反之，白芦笋的抗氧化性较弱。

3 结论

采用超声波辅助提取两种芦笋中的酚类物质，结果显示：绿芦笋和白芦笋均不含单宁类物质。总酚、总黄酮、总单宁、缩合单宁及HPLC结果表明，绿芦笋样品中酚类物质的种类、含量及抗氧化活性均显著高于白芦笋样品；并且两种芦笋尖中酚类物质的含量及抗氧化活性均高于芦笋茎。相关性分析发现，芦笋中酚类物质含量与DPPH自由基、ABTS自由基清除活性显著相关。综上所述，芦笋种类及部位对其抗氧化活性具有显著的影响，这为芦笋的开发利用提供科学依据。然而，除芦丁外，芦笋中其它抗氧化活性贡献基础还不清楚，这需要通过进一步的分离提纯及物质鉴定技术进一步展开研究。