NaCl胁迫联合Ca2+调控糙米发芽富集GABA的工艺优化

（吉林工商学院粮食学院，吉林长春130507）

糙米营养丰富，但由于保留了富含纤维质的米糠层，使其口感较差、不易消化，严重限制了其销量[1]。研究发现，糙米经发芽后，食用品质改善、化学成分改变[2]、营养价值会明显提高[3]，同时会富集一些功能性营养成分[4-5]，尤其是对人体具有生理调节功能的γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），其含量是糙米的3 倍，大米的 10 倍[2，6]。

GABA是一种天然存在的四碳非蛋白质氨基酸，因具有改善脑机能、降血压、抗衰老、促进长期记忆以及预防消化道癌症等多种保健功能，近年来受到国内外的广泛关注[7-8]。研究表明，植物中的GABA合成转化途径有两条，谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）和二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）分别为这两条途径合成GABA的关键酶[9]，其中GAD起主导作用。当植物受到冷激、热激、干旱、低氧胁迫、酸胁迫及盐胁迫等逆境胁迫时，会强烈刺激两种酶的活性，从而使GABA大量富集[10]，其中盐胁迫法简单易行，且安全环保[11]。GAD是一种Ca2+/钙调节依赖型酶，具有一个钙调蛋白结合区[12]。已有学者研究发现，在植物籽粒发芽期间，施用Ca2+有助于GABA富集[13-14]。目前，盐胁迫[1]、低氧胁迫[15]、低温胁迫[16-17]对发芽糙米富集GABA的影响已有研究，而对NaCl胁迫联合Ca2+处理下，优化培养条件富集糙米GABA的研究还鲜有报道。

本文采用NaCl胁迫联合Ca2+处理的方式培养糙米发芽，通过Box-Behnken响应面分析法优化了发芽糙米富集GABA的工艺条件，研究了NaCl浓度、Ca2+浓度、发芽温度及发芽时间4个因素对GABA富集的影响，以期为糙米的开发利用及富含GABA健康食品的制备提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糙米：品种为龙粳31，产自黑龙江省；GABA标准品（纯度＞99%）：Sigma试剂公司；其他试验试剂均为分析纯；试验用水均为三级水。

1.2 仪器与设备

LHS-250HC-I型恒温恒湿箱、DHG-9245A型鼓风干燥箱、HWS-24型电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；JXFM110型锤式旋风磨：杭州大吉光电仪器有限公司；N2型分光光度计：上海仪电科学仪器股份有限公司；LE204E型分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；TGL-10C型高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 糙米发芽处理

选取籽粒饱满、成熟度高、无裂痕的糙米粒，每份10.0 g，蒸馏水冲洗3遍，浸泡于1%的次氯酸钠溶液中灭菌10 min，蒸馏水冲洗数次后滤干。加入10倍体积的一定浓度的NaCl和CaCl2混合溶液，30℃下浸泡12 h，取出后均匀的摊于铺有湿润纱布的培养皿中，盖上纱布，其中纱布已用NaCl和CaCl2混合溶液润湿，转入恒温恒湿培养箱中培养，培养过程中，每隔4小时均匀喷洒2 mL NaCl和CaCl2混合溶液。培养结束后，用蒸馏水清洗3遍，放入45℃鼓风干燥箱中烘干，粉碎后即为发芽糙米粉，过80目筛，于4℃保存，备用。

1.3.2 发芽糙米中GABA含量的测定

采用Berthelot法测定发芽糙米中的GABA。准确称取2.0 g发芽糙米粉，蒸馏水定容至10 mL，超声提取2小时后，3 000 r/min离心15 min，上清液中吸取400μL置于微量离心管中，加入600 μL pH=9.0硼酸缓冲溶液，混匀后分别加入质量分数为6%的重蒸苯酚溶液2 mL和质量分数为7.5%的次氯酸钠溶液1 mL，振荡混匀。沸水浴中煮沸10 min，迅速取出，置于冰浴中冷却20 min，待溶液出现蓝绿色后，加入体积分数为60%的甲醇溶液，630 nm处测定溶液吸光度值[18]。

1.3.3 单因素试验

以NaCl溶液浓度、Ca2+溶液浓度、发芽温度和发芽时间为试验考察因素，以GABA为考察指标，确定各因素对GABA富集量的影响。

表1 糙米发芽试验方案Table 1 Design of experiment of germinated brown rice

1.3.4 Box-Behnken响应面优化设计

结合单因素试验结果，根据Box-Behnken试验原理进行四因素三水平的试验设计。采用Design-Expert 10.0进行试验设计，以GABA含量为指标，对响应面试验所得数据进行回归分析，拟合优化出最佳富集GABA的工艺条件。试验自变量因素编码及水平见表2。

表2 响应面试验因素水平Table 2 Factors and levels used in response surface experiments

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.2.1 NaCl溶液浓度对发芽糙米中GABA含量的影响

NaCl溶液浓度对发芽糙米中GABA含量的影响见图1。

图1NaCl溶液浓度对发芽糙米中GABA含量的影响Fig.1 Effect of sodium chloride concentration on GABA content in germinated brown rice

如图1所示，不同浓度的NaCl溶液对发芽糙米中GABA含量的影响具有显著性差异（P＜0.05）。NaCl溶液浓度低于10 mmol/L时，GABA含量随着NaCl溶液浓度的增加而增大。这是由于NaCl溶液在一定浓度范围内会造成植物处于盐胁迫逆境，从而促进GABA生成[19]。当NaCl溶液浓度达到10 mmol/L时，发芽糙米中GABA含量达到最大值，为101.82 mg/100 g，为未添加NaCl组（84.04 mg/100 g）的 1.21倍，此后，随着 NaCl溶液浓度增大，GABA含量呈减小趋势。

2.2.2 Ca2+溶液浓度对发芽糙米中GABA含量的影响

Ca2+溶液浓度对发芽糙米中GABA含量的影响见图2。

图2 Ca2+溶液浓度对发芽糙米中GABA含量的影响Fig.2 Effect of Ca2+concentration on GABA content in germinated brown rice

如图2所示，不同浓度的Ca2+溶液对发芽糙米中GABA含量的影响具有显著性差异（P＜0.05）。Ca2+浓度在0～40 mmol/L时，发芽糙米GABA含量随着Ca2+浓度的升高呈现先增加后降低的趋势。这是由于添加Ca2+可提高GAD的活力[20]。当Ca2+溶液在20mmol/L时，GABA含量最高，为106.25 mg/100 g，为未添加Ca2+组（77.37 mg/100 g）的1.37倍。这表明在糙米发芽过程中，添加适当浓度的Ca2+溶液有助于富集GABA。

2.2.3 发芽温度对发芽糙米中GABA含量的影响

发芽温度对发芽糙米中GABA含量的影响见图3。

图3 发芽温度对发芽糙米中GABA含量的影响Fig.3 Effect of germination temperature on GABA content in germinated brown rice

如图3所示，发芽温度对糙米发芽富集GABA具有显著性差异（P＜0.05）。发芽糙米的GABA主要是由发芽期间，糙米的胚芽所产生的[21]。当浸泡温度较低时，不利于糙米发芽。随着温度的升高，糙米发芽速度变快，同时GAD的活性也随着温度的提高而升高。当发芽温度在30℃时，GABA含量最高，为104.46 mg/100 g。随着温度的上升，GAD的活性受到抑制，导致GABA含量降低。因此，糙米发芽最适温度为30℃。

2.2.4 发芽时间对发芽糙米中GABA含量的影响

发芽时间对发芽糙米中GABA含量的影响见图4。

图4 发芽时间对发芽糙米中GABA含量的影响Fig.4 Effect of germination time on GABA content in germinated brown rice

如图4所示，在1 d～2.5 d之间，随着发芽时间的增加，GABA含量明显增加，表明发芽时间对GABA含量具有显著性差异（P＜0.05）。当发芽2.5 d时，GABA含量为115.39 mg/100 g。发芽时间超过2.5 d时，随着发芽时间的延长，GABA富集速度明显变慢，当发芽时间为3 d时，GABA含量为115.80 mg/100 g，与2.5 d没有显著性差异（P＞0.05），并且发芽时间过长，GABA会在转氨酶的作用下，转换成琥珀酸半醛，从而使GABA含量下降[22]。同时，发芽时间过长，会导致微生物生长，糙米发生霉变，品质下降。综合考虑，发芽时间为2.5 d较为适宜。

2.2 响应面分析法优化糙米发芽工艺条件

2.2.1 Box-Behnken试验设计及结果分析

根据单因素试验结果，应用Design-Expert软件，以 NaCl溶液浓度（X1）、Ca2+溶液浓度（X2）、发芽温度（X3）和发芽时间（X4）作为自变量，以GABA含量为响应值（Y），进行四因素三水平的Box-Behnken试验，试验设计及试验结果见表3。

表3 Box-Behnken试验设计及结果Table 3 Experiments design and results of Box-Behnken

2.2.2 回归模型的建立及显著性检验结果

对表3试验结果采用Design-Expert软件进行二次回归响应面分析，建立了GABA（Y）二次响应面回归模型，拟合的二次多项式方程为：Y=132.07-21.01X1-11.07X2-1.99X3-1.88X4+15.53X1X2+6.25X1X3+8.28X1X4-0.30X2X3+6.74X2X4+10.95X3X4-16.40X12-21.56X22-20.36X32-15.07X42。

对该模型进行显著性检验，结果见表4。

表4 发芽糙米GABA富集条件优化回归模型显著性检验Table 4 Significance test for the regression equation of optimal GABA accumulation conditions in germinated brown rice

该模型的相关系数R2=0.992 6，修正相关系数R2Adj=0.985 1，表明所建立的模型能解释98.51%响应值的变化，可以用此模型对糙米发芽富集GABA试验进行分析和预测。X1、X2、X1X2、X1X3、X1X4、X2X4、X3X4、X12、X22、X32及 X42均对 GABA 含量具有极显著影响（P＜0.01），X3和 X4对 GABA 含量具有显著影响（P＜0.05）。X2X3对GABA含量影响不显著（P＞0.05）。四因素对GABA 含量的影响顺序为 X1＞X2＞X3＞X4。剔除不显著项，拟合方程修订为：Y=132.07-21.01X1-11.07X2-1.99X3-1.88X4+15.53X1X2+6.25X1X3+8.28X1X4+6.74X2X4+10.95X3X4-16.40X12-21.56 X22-20.36X32-15.07X42。

图5为GABA含量的实测值与模型预测值之间的相关性分析，相关系数R2=0.996 3，表明两者之间的相关性极好。综上所述，所建立模型能很好的对GABA含量进行预测。

图5 发芽糙米GABA含量实测值与预测值之间的相关性Fig.5 Correlation between predicted and observed values of GABA content in germinated brown rice

2.2.3 响应面分析

图6 NaCl溶液浓度（X1）和 Ca2+溶液浓度（X2）响应面图和等高线图Fig.6 Response surface and contour polt showing the effects of sodium chloride concentration（X1）and Ca2+concentration（X2）

图7 NaCl溶液浓度（X1）和发芽温度（X3）响应面图和等高线图Fig.7 Response surface and contour polt showing the effects of sodium chloride concentration（X1）and germination temperature（X3）

图8 NaCl溶液浓度（X1）和发芽时间（X4）响应面图和等高线图Fig.8 Response surface and contour polt showing the effects of sodium chloride concentration（X1）and germination time（X4）

图9 Ca2+溶液浓度（X2）和发芽温度（X3）响应面图和等高线图Fig.9 Response surface and contour polt showing the effects of Ca2+concentration（X2）and germination temperature（X3）

图10 Ca2+溶液浓度（X2）和发芽时间（X4）响应面图和等高线图Fig.10 Response surface and contour polt showing the effects of Ca2+concentration（X2）and germination time（X4）

图6～图11为根据线性回归模型绘制的响应面及其等高线图。根据此结果可以直观分析因素间的交互作用对GABA含量的影响。响应面越陡峭，表明该试验条件的改变对GABA含量影响越大[23]。从响应面图可以看出，4个因素所形成的坡度都比较陡峭，尤其是X1和X2两个因素更为陡峭，表明NaCl浓度和Ca2+浓度对GABA含量的影响较其余两个因素要大。4个因素的变化趋势均为先增大后降低，6个响应面均存在一个极大值点。等高线的性状反应了因素间的交互作用的强弱，等高线呈椭圆形，表明两个因素的交互作用显著，呈圆形，则表明两个因素的交互作用不显著[24]。除图9外，5个等高线图均呈椭圆形，表明除Ca2+浓度和发芽温度交互作用不显著外，其余各两因素间交互作用显著。这一结果与显著性分析结论相符。

图11 发芽温度（X3）和发芽时间（X4）响应面图和等高线图Fig.11 Response surface and contour polt showing the effects of germination temperature（X3）and germination time（X4）

2.2.4 最优条件的确定及验证

根据响应面优化分析，得到糙米发芽富集GABA的最佳工艺条件为NaCl溶液浓度为7.390 mmol/L，Ca2+溶液浓度为14.940 mmol/L，发芽温度为28.829℃，发芽时间为2.298 d，预测发芽糙米GABA含量为145.29 mg/100 g。根据实际操作条件，将富集工艺调整为NaCl溶液浓度为7.50 mmol/L，Ca2+溶液浓度为15.0 mmol/L，发芽温度为29℃，发芽时间为2.3 d。在此条件下进行糙米发芽富集GABA，作6次平行试验，得GABA平均含量为144.98 mg/100 g。预测值与实测值相对误差较小，说明所建立的模型具有较好的准确性及可靠性。

3 结论

在单因素试验的基础上，以GABA含量为指标，采用Design-Expert软件应用Box-Behnken响应面法进行四因素三水平优化试验。方差分析结果表明NaCl浓度和Ca2+浓度对GABA含量具有极显著性影响；NaCl浓度和Ca2+浓度、NaCl浓度和发芽温度、NaCl浓度和发芽温度、Ca2+浓度和发芽时间、发芽温度和发芽时间的交互作用对GABA含量具有极显著性影响；发芽温度和发芽时间对GABA含量具有显著性影响；Ca2+浓度和发芽温度的交互作用对GABA含量无显著性影响。由回归方程得出，当NaCl浓度为7.390 mmol/L，Ca2+溶液浓度为14.940 mmol/L，发芽温度为28.829℃，发芽时间为2.298 d时，发芽糙米GABA含量最大，预测值为145.29 mg/100 g。考虑到实际操作的可行性，最后优化的富集条件为NaCl浓度为7.50 mmol/L，Ca2+浓度为15.0 mmol/L，发芽温度为29℃，发芽时间为2.3 d。通过验证试验，实测值与预测值基本相符，说明所建立的回归模型可较为准确的预测发芽糙米GABA含量，通过优化，可有效提高GABA含量，具有一定的实际指导意义。