豆浆豆腐中胰蛋白酶抑制因子活性的研究

孙雪飞，于寒松，2，*，谷春梅，*

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118；2.国家大豆产业技术研究开发中心加工研究室，吉林长春130118）

中国是大豆的故乡，同时也是最早研发生产豆制品的国家。豆制品是平衡膳食的重要组成部分。大豆营养价值丰富，是人和动物的主要蛋白质来源，很多人把豆浆、豆腐作为必选的早餐之一[1-2]。但由于其含有多种抗营养因子，阻碍营养物质的吸收，因此很大程度上限制了大豆的直接利用[5-6]。胰蛋白酶抑制因子是最主要的一类抗营养因子[7-8]，约占大豆蛋白的6%。大豆胰蛋白酶抑制因子的含量受多种因素的影响，例如大豆的品种以及加工工艺等[9-10]。随着科学技术的发展，多种钝化或消除胰蛋白酶抑制因子的技术不断涌出，可以概括为物理法、化学法和生物学方法[11]。

本研究采用干法生浆（dry soybean-boiling after filtration，DS-BAF）、干法熟浆（dry soybean-boiling before filtration，DS-BBF）、湿法生浆（soaked soybeanboiling after filtration，SS-BAF）、湿法熟浆（soaked soybean-boiling before filtration，SS-BBF）、发芽豆生浆（germination soybean-boiling after filtration，GS-BAF）、发芽豆熟浆（germination soybean-boiling before filtration，GS-BBF），6种制浆工艺并以克山1号、濉科12、徐豆14、圣豆9、圣豆10等5种大豆为原料进行豆浆制备[12-13]，测定大豆中蛋白质及豆浆中水溶性蛋白，并以CaSO4为凝固剂制备豆腐[14-15]，通过分析豆浆、豆腐产量与豆浆蛋白含量的关系，在保证豆制品产率的同时对其进行胰蛋白酶抑制因子活性的测定[16-17]，得出产量最大、蛋白质含量最高、胰蛋白酶抑制因子活性最低的品种以及最佳加工工艺，对于工业化生产中降低胰蛋白酶抑制因子含量，提高产品产率及豆制品加工适用性具有重要意义[18-19]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

克山1号、濉科12、徐豆14、圣豆9、圣豆10：东北农业大学试验站提供。

胰蛋白酶、苯甲酰－dl－精氨酸－p－硝基酰替苯胺盐酸盐（benzoyl-DL-arginine-P-nitroanilide hydrochloride，BAPA）、二甲基亚砜溴甲酚绿、硼酸、氢氧化钠、甲基红、亚甲基蓝：北京鼎国有限公司。

1.2 仪器与设备

RU-190紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；FD-IB-50冷冻干燥机：北京博医康实验仪器公司；3-18k台式冷冻离心机：德国SIGM公司；ULT-1386-3-V-80℃超低温冰箱：Thermo公司；C21-WK2102电磁炉：广东美的电器制造有限公司；-4℃低温冰柜：Haier公司；DHG-9240电热恒温鼓风干燥箱：精宏仪器有限公司；SB25-12DTD超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的制备

将5种大豆分别粉碎后过100目筛，准确称量1.0000g（精确至0.002g）于250mL锥形瓶中，用50 mL浓度为0.006 mol/L的氢氧化钠溶液在25℃、150 r/min条件下提取0.5 h后，用1 mol/L氢氧化钠或1 mol/L盐酸将溶液的pH值调为9.5～9.8，继续提取2.5 h后，4 000 r/min离心10 min，弃沉淀留上清。

1.3.2 豆浆及豆腐的制备工艺

1.3.2.1 豆浆的制备

干法生浆：干燥——磨浆——过滤——水浴——煮沸——熟豆浆。

干法熟浆：干燥——磨浆——水浴——煮沸——过滤——熟豆浆。

湿法生浆：浸泡——磨浆——过滤——水浴——煮沸——熟豆浆。

湿法熟浆：浸泡——磨浆——水浴——煮沸——过滤——熟豆浆。

大豆的发芽：将130 g质地优良的大豆放入盆中，用水清洗2次～3次，然后用80℃水浸泡5 min，迅速冲入45℃温水，浸泡3 h～4 h后将豆子捞出，在上面覆盖2层纱布避光，放入25℃恒温培养箱，每隔5小时～6小时淋一次水，3天后使用。

1.3.2.2 豆腐的制备

称取130g无杂的优质大豆，清洗后加入650mL的蒸馏水浸泡 14 h～16 h，沥干后按照豆：水为1∶9（g/mL）加入蒸馏水进行磨浆3 min，磨浆后用120目的滤布将豆渣充分过滤去除，将制得的生豆浆放在水浴锅中进行加热，待豆浆温度达到90℃时，计时10 min，然后将豆浆移至电热炉保持沸腾5min。用搅拌器在240r/min条件下搅拌豆浆，使豆浆温度降为86℃时迅速加入凝固剂 CaSO4，（2.8 g，2%），搅拌均匀后在保温套中保温12 min，此时不宜移动，然后将豆腐均匀破碎，先用10kg的重物压制15min，继而用20kg重物压制15min，得到豆腐样品，将其放在4℃冰箱中保藏24 h。

1.4 豆浆产量的测定

测定豆浆中蛋白质为6 Brix时的体积，结果用mL表示。

1.5 豆腐产量的测定

将新鲜的豆腐在室温下静置5 min称重，计算每130 g大豆所得新鲜豆腐的重量。

1.6 豆浆蛋白质回收率的测定[20]

采用凯氏定氮法，参照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中方法。

蛋白质回收率/%=豆浆中蛋白质含量/原料豆中蛋白质含量×100

1.7 胰蛋白酶抑制因子活性的测定[20-22]

参考燕方龙等发表的方法，略有改动，过程简述如下：

1）酶浓度的调整，使胰蛋白酶溶液浓度的吸光度范围在0.380～0.420之间。

2）样品浓度的调整，使其1.0 mL样品稀释液的吸光度范围在0.190～0.210之间。

3）测定样品中胰蛋白酶抑制因子活性。

按公式计算样品中胰蛋白酶抑制剂活性：U=TIU×50×D/m

式中：U为每克样品中胰蛋白酶抑制剂活性，TIU/g，TIU为每毫升样品中胰蛋白酶抑制剂活力；50为样品萃取液体积，mL；D为样品提取液的稀释倍数；m为样品的质量，g。

2 结果与分析

2.1 不同制浆工艺对豆浆中蛋白质回收率及豆腐产量的影响

采用干法生浆、干法熟浆、湿法生浆、湿法熟浆、发芽豆生浆、发芽豆熟浆加工工艺对克山1号、濉科12、徐豆14、圣豆9、圣豆10所制得的豆浆、豆腐产量以及豆浆中蛋白质回收率的测定结果见表1。

表1 不同大豆品种及制浆工艺对豆浆中蛋白质回收率及豆浆、豆腐产量的影响Table 1 Effects of different soybean varieties and pulping technology on protein recovery in soybean milk and soybean milk yield and tofu produce

由表1中数据可知，不同大豆品种采用的不同制浆工艺制备的豆浆、豆腐产量均具有显著性差异（P＜0.05），在相同品种下，熟浆所制备的豆浆平均产量为175.92 mL；熟浆所制备豆腐的平均产量为378.67 g。生浆所制备豆浆的平均产量为169.33 mL；生浆所制备豆腐的平均产量为362.0 g。生浆制备的豆浆中水溶性蛋白平均含量为27.70 g/100 g；熟浆制备的豆浆中水溶性蛋白平均含量为28.02 g/100 g。采用浸泡豆所制得的豆浆中水溶性蛋白含量低于干豆所制得的豆浆中水溶性蛋白含量，大豆浸泡吸水后，使得豆浆产量降低，营养物质减少。然而豆子发芽后所制得的豆浆中蛋白含量明显低于干豆所制得豆浆中蛋白含量。采用湿法工艺时豆腐产量最大为395.5 g；采用半干法工艺时豆腐平均产量为367.6 g；以发芽豆为原料所制备的豆腐平均产量最低为348.8 g。由此可得熟浆工艺制备的豆浆、豆腐的产量大于生浆工艺，这是由于熟浆工艺的温度较高，蛋白质更易提取出来。综上所述，依次采用湿法熟浆、湿法生浆、半干法熟浆、半干法生浆、发芽豆熟浆、发芽豆生浆所得豆制品水溶性蛋白回收率依次降低。

2.1.2 不同制浆工艺对豆浆、豆腐品质间相关性分析

干法生浆对大豆品质性状间的相关性分析见表2～表 7。

由相关性分析表明，不同制浆工艺豆浆、豆腐产量以及水溶性蛋白含量，这3项指标两两均呈现显著正相关关系，采用干法生浆、湿法生浆、湿法熟浆、发芽熟浆时，蛋白质回收率与上述3个指标同样呈现正相关关系，而采用干法熟浆时，水溶相蛋白与蛋白质回收率呈现负相关关系，采用发芽生浆工艺时，蛋白质回收率与上述3个指标呈现负相关关系。

表2 干法生浆对大豆品质性状间的相关性分析Table 2 Analysis of correlation between the quality characters of soybean with dry pulp

表3 干法熟浆对大豆品质性状间的相关性分析Table 3 Analysis of correlation between the quality characters of soybean with dry cooked pulp

表4 湿法生浆对大豆品质性状间的相关性分析Table 4 Analysis of correlation between the quality characters of soybean with wet pulp

表5 湿法熟浆对大豆品质性状间的相关性分析Table 5 Analysis of correlation between the quality characters of soybean with wet cooked pulp

表6 发芽生浆对大豆品质性状间的相关性分析Table 6 Analysis of correlation between the quality characters of soybean with germination pulp

表7 发芽熟浆对大豆品质性状间的相关性分析Table 7 Analysis of correlation between the quality characters ofsoybean with germination cooked pulp

在相同制浆工艺时，不同品种所制得的豆浆、豆腐产量与豆浆中水溶性蛋白含量成正相关。这在一定程度上说明豆浆中水溶性蛋白含量越高，豆浆、豆腐产量越高，这与黄明伟等试验结果一致。综上所述，依次采用干法熟浆、干法生浆、湿法熟浆、湿法生浆、发芽豆熟浆、发芽豆生浆所得豆制品水溶性蛋白含量依次降低。

2.2 不同制浆工艺对胰蛋白酶抑制因子活性的影响

采用干法生浆、干法熟浆、湿法生浆、湿法熟浆、发芽豆生浆、发芽豆熟浆加工工艺对克山1号、濉科12、徐豆14、圣豆9、圣豆10所制得的豆浆、豆渣、豆腐、黄浆水中胰蛋白酶抑制因子活性测定结果见表8。

表8 不同大豆品种及制浆工艺对豆浆、豆腐中胰蛋白酶抑制因子活性的影响Table 8 Effects of different soybean varieties and pulping process on trypsin inhibitor activity in soybean milk and tofuTIU/g

如表8中数据可知，不同品种不同加工工艺制得的豆浆、豆渣、黄浆水、豆腐中的胰蛋白酶抑制因子活性具有显著性差异（P＜0.05）。大豆中胰蛋白酶抑制因子含量由于品种、产地、年份的不同而有所差异，本试验中大豆经过制浆后，豆浆、豆渣、黄浆水、豆腐中胰蛋白酶抑制因子活性与原料豆相比显著降低（P＜0.05），说明打磨加热过程对胰蛋白酶抑制因子活性有很大影响。通过表中数据发现，浸泡和发芽豆能减低胰蛋白酶抑制因子活性，这与杨道强等试验结果一致。在浸泡过程中，胰蛋白酶抑制因子活性降低是因为一部分水溶性的胰蛋白酶抑制因子溶于浸泡豆子的水中，另一方面由于大豆中一些水解酶的激活降解了部分胰蛋白酶抑制因子。经过发芽后大豆制作的豆浆、豆腐中胰蛋白酶抑制因子活性如表所示，以发芽后大豆为原料所制得的豆浆、豆腐中胰蛋白酶抑制因子活性显著低于发芽前（P＜0.05），并且与浸泡后的豆子所制得的豆浆、豆腐中相比，胰蛋白酶抑制因子活性最低。这是由于发芽过程中各种酶被激活，使胰蛋白酶抑制因子逐步水解，用于胚芽生长而降低了活性。通过生浆与熟浆数据对比发现，熟浆所制得豆浆、豆腐中胰蛋白酶抑制因子活性明显低于生浆，说明加热有效地使胰蛋白酶抑制因子失活。由此可见，同时采用熟浆工艺与发芽豆相结合使胰蛋白酶抑制因子活性降低的效果最好。

3 讨论

豆制品中含有蛋白酶抑制因子、凝集素、皂苷等抗营养因子，豆制品产量是一个重要指标，本研究选取胰蛋白酶抑制因子进行分析测定，采用紫外分光光度法测其活性。本试验采取6种不同的制浆工艺，旨在分析不同的制浆工艺对胰蛋白酶抑制因子活性的影响，在保证豆制品产量最大的前提下，找出抑制因子活性最低的工艺，为豆制品加工适用性及工业生产提供理论依据。

试验结果表明，不同品种及制浆工艺对豆浆、豆腐产量以及豆浆中水溶性蛋白含量有很大影响，采用湿法熟浆所制得的豆腐产量最大，平均值约为415.4 g，这与郭顺堂试验结果一致[23]。采用发芽豆生浆所制得的豆腐产量最小，平均值约为330.7 g。通过试验数据可知，不同制浆工艺对不同品种的豆浆、豆渣、豆腐、黄浆水中胰蛋白酶抑制因子活性具有显著性差异，这说明不同工艺、不同品种对胰蛋白酶抑制因子活性产生的影响很大。通过比较可以发现徐豆14与濉科12有利于工业生产胰蛋白酶含量较低的豆制品。在以徐豆14为原料时，干法熟浆中活性降低的程度低于干法生浆，降幅达到2%，说明热处理可以有效降低豆浆、豆腐中的胰蛋白酶抑制因子的活性；在湿法熟浆与干法熟浆的比较中发现，湿法熟浆的豆浆、豆腐中抑制因子活性低于干法熟浆，降幅达到1.5%，这有可能是在浸泡过程中一部分胰蛋白酶抑制因子随水分流失，降低了豆子中胰蛋白酶抑制因子的含量。这与吴非、李红梅等研究结果一致[24]。在以濉科12为原料时发现发芽豆生浆所制得的豆浆、豆腐中胰蛋白酶抑制因子活性低于湿法生浆，说明有可能在种子萌发过程中，大豆胰蛋白酶抗营养因子被种子自身的酶系所分解[25]。

综上所述，可以发现与干法制浆相比，湿法制浆和发芽豆处理均降低了胰蛋白酶抑制因子活性，其中发芽处理的效果最佳，并且采用同种方法不同品种间抗营养因子活性降低程度和幅度也不同。这与朱晓倩等[26]的结果研究一致。Osman研究发现，扁豆在发芽1天后，胰蛋白酶抑制剂含量即显著降低（P＜0.05），且随着发芽时间的延长，降低更为显著，5天后其含量下降19.4%[27]。所以在采用相同制浆工艺时，徐豆14和濉科12为原料有利于工业生产较低大豆胰蛋白酶抑制因子含量的豆制品；在同一品种的条件下，发芽豆湿法熟浆制浆工艺所制得的豆制品胰蛋白酶抑制因子含量较低。综合蛋白含量考虑，以濉科12为原料采用湿法熟浆制浆工艺能生产出高蛋白含量、低抑制因子活性的豆制品。