不同参数的超声对脂多糖诱导人系膜细胞增殖的影响

孙彭菲，田 甜，徐珊珊，付荣国，王 冰，任淑婷

(1. 西安交通大学医学部基础医学院病理学系，陕西西安 710061；2. 西安市中心医院病理科，陕西西安 710004；3. 西安交通大学生命科学与技术学院生物医学工程系，陕西西安 710049；4. 西安交通大学第二附属医院肾内科，陕西西安 710004)

肾小球肾炎是引起慢性肾功能衰竭的最主要原因，严重危害人类的健康和生命[1]。糖皮质激素是大多数原发性肾小球肾炎临床治疗的首选药和基础治疗药，具有强大的抗炎和免疫抑制作用[2]。然而，激素虽可减轻或延缓慢性肾脏疾病的进展，但长期应用易使患者发生感染、糖代谢和脂代谢紊乱及骨质疏松等诸多不良反应[2-4]。因此，寻找更安全、简便的肾脏局部抗炎治疗、克服全身激素治疗引起的副作用是目前肾小球肾炎治疗研究的重要方向。

超声被认为是一种安全、简便、且可重复使用的无创性治疗新技术，已被应用于很多疾病治疗领域，如促进创伤组织再生、肿瘤治疗和刺激血管再生等[5-8]。研究显示，超声联合造影剂微泡可通过增强超声空化效应以促进药物或基因在局部组织细胞的靶向递送[6-7]。因此，超声联合微泡作为一种安全、有效、操作简单、具有一定靶向、无创性的基因治疗和药物输送手段，已被应用于很多疾病治疗研究领域[9-11]。然而，目前超声在肾小球肾炎治疗方面的相关研究鲜见报道。基于不同参数超声的生物学效应不同，选择合适超声参数对今后超声联合微泡和(或)糖皮质激素进行肾小球肾炎局部靶向治疗研究至关重要。

本实验通过脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导人系膜细胞(human mesangial cell, HMC)增殖以建立体外细胞炎症增殖模型，观察不同参数的超声对细胞增殖的抑制作用，旨在选择既能有效爆破微泡，又能避免对细胞的不可逆杀伤作用的合适超声参数，为今后超声联合微泡和(或)药物的局部靶向抗肾小球肾炎的研究奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1主要试剂和仪器RPMI 1640培养基和胎牛血清均购自Hyclone公司；青霉素、链霉素、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)和胰酶均购自Sigma公司；二甲基亚砜(DMSO)购自广东光华化学试剂厂；超声耦合剂购自天津诚信医用辅助材料厂。CO2培养箱和酶标仪均购自美国热电有限公司；超声治疗仪(超声频率0.8 MHz，探头面积2.8 cm2)购自北京天行健医疗有限公司；倒置显微镜XDS-2购自重庆光电仪器有限公司。

1.2细胞株HMC由西安交通大学医学部第二附属医院肾内科付荣国教授惠赠。

1.3HMC的培养细胞培养于含100 mL/L胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的RPMI 1640完全培养基中，并置于37 ℃、50 mL/L CO2培养箱中培养。

1.4实验分组和处理

1.4.1 不同参数的超声对LPS诱导HMC增殖的影响—超声3因素3水平正交试验 以超声强度、占空比(超声波发出时间与间歇时间之比)和辐照时间为3个影响因素，每个因素设定3个水平，选用L9(34)正交表，未考虑空列和交互作用，实验误差估计通过重复试验获得。正交试验因素水平表见表1。根据正交试验表设计不同实验组，探索各因素的超声对LPS诱导HMC增殖的抑制主次效应，为今后超声联合微泡和(或)药物治疗肾小球肾炎、筛选合适超声参数奠定基础。实验共分11个组，见表2，实验重复3次。

表1正交试验因素与水平表

Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

水平因素占空比(A)声强(B,W/cm2)时间(C,min)11∶4(A1)1.48(B1)5(C1)21∶1(A2)2.56(B2)10(C2)34∶1(A3)2.79(B3)15(C3)

1.4.2 占空比为1∶1时，不同声强和辐照时间的超声对LPS诱导HMC增殖的影响 结合课题组以往对超声抑制肿瘤细胞生长的实验研究、实验可操作性和对本实验1.4.1项中正交试验数据的分析结果，探索占空比为1∶1时不同声强和辐照时间的超声对LPS诱导HMC增殖的影响，进一步为超声联合微泡和(或)药物治疗肾小球肾炎筛选合适的超声参数奠定实验基础。实验分组见表3。

表2正交试验分组

Tab.2 Orthogonal experiment grouping

组别LPS(10μg/mL)超声占空比(A)声强(B,W/cm2)时间(C,min)实验1组+1∶4(A1)1.48(B1)5(C1)实验2组+1∶4(A1)2.56(B2)10(C2)实验3组+1∶4(A1)2.79(B3)15(C3)实验4组+1∶1(A2)1.48(B1)10(C2)实验5组+1∶1(A2)2.56(B2)15(C3)实验6组+1∶1(A2)2.79(B3)5(C1)实验7组+4∶1(A3)1.48(B1)15(C3)实验8组+4∶1(A3)2.56(B2)5(C1)实验9组+4∶1(A3)2.79(B3)10(C2)模型组+---对照组----

表3实验分组

Tab.3 Experiment grouping

组别LPS(10μg/mL)超声占空比声强(W/cm2)时间(min)实验1组+1∶12.185实验2组+1∶12.565实验3组+1∶12.795实验4组+1∶12.1810实验5组+1∶12.5610实验6组+1∶12.7910模型组+---对照组----

1.4.3 处理 当HMC处于对数生长期时，用2.5 g/L胰蛋白酶消化细胞，以每孔1.0×104个细胞接种于96孔培养板中，每组设4个复孔，将培养板放入含50 mL/L CO2的37 ℃培养箱中静置培养。培养24 h后，取出培养板，于各实验组和模型组中加入LPS并使其终浓度为10 μg/mL，再给予各实验组细胞不同参数的超声处理。将超声探头置于细胞培养板底部，并在超声探头与培养板之间涂抹厚约2 mm的超声耦合剂。处理完成后，清除培养板底的耦合剂并用750 mL/L乙醇消毒，将培养板放入CO2培养箱中继续培养24 h。对照组细胞未进行任何处理。实验重复3次。

1.5细胞形态学观察超声辐照处理细胞后24 h，于倒置显微镜下观察各组细胞的形态。

1.6MTT法测定HMC生长抑制率超声辐照后的细胞继续培养24 h后，向96孔培养板中加入5 mg/mL的MTT溶液每孔20 μL，继续孵育4 h后，取出96孔板，小心吸弃上清液，向各孔中加入150 μL DMSO，在酶标仪中震荡10 min，于490 nm测定吸光度(A)值，计算各组细胞生长抑制率。抑制率(%)=(1-A实验组/A模型组)×100%

2 结 果

2.1不同参数的超声对LPS诱导HMC增殖的影响

2.1.1 不同参数的超声对细胞形态学的影响 与对照组相比，模型组细胞密度明显增加，但细胞形态与对照组相似，均呈多角形，说明LPS明显促进HMC增殖。给予不同参数的超声处理后24 h，各实验组细胞形态呈现不同程度的变化。与模型组相比，在实验5、7、8、9组中，HMC形态学变化明显，多数细胞失去正常的多角形而变为比较规则的圆形，细胞伪足消失，且细胞密度显著降低，其中实验9组中的细胞形态学改变最显著；其他各组细胞的形态和细胞密度则未见明显变化(图1)。

2.1.2 不同参数的超声对细胞增殖生长的抑制作用 不同参数的超声处理后24 h，各实验组中的HMC生长出现不同程度地抑制，见表4。根据极差分析法，表4中的 K1、K2、K3值是每列相应水平的细胞抑制率数据之和，K1′、K2′、K3′值是每个因子同一水平细胞抑制率的平均值。R为极差，表示各个因子效应的大小。R绝对值越大，表示该因子对细胞抑制率影响越高，即该参数的超声对LPS诱导HMC增殖抑制的效应越好。从表4中各因素R值和K′值可见，在这三个超声参数中，占空比对LPS诱导HMC生长抑制率的影响最大，其次为超声辐照时间和超声强度。其中，占空比和超声辐照时间从低到高的过程中均呈正性影响，而超声强度从低到中的过程呈正性影响。与极差分析结果基本一致，方差分析结果(表5)显示，超声占空比和辐照时间对LPS诱导HMC生长抑制率的影响显著(P<0.05)，而声强对LPS诱导HMC生长抑制率有一定的影响，但无统计学意义(P>0.05)，其中占空比对LPS诱导HMC生长抑制率的影响最大，其次为超声辐照时间和超声强度。因此，对LPS诱导HMC增殖生长抑制影响最强的超声参数组合为A3B2C3。然而，在超声联合微泡和(或)药物实现局部靶向递药治疗的过程中，既能有效爆破微泡，又能避免对细胞不可逆杀伤作用的超声，才是最理想或合适的超声参数，即对细胞生长有一定抑制作用，且能保证大部分细胞存活的超声参数。

图1 不同参数的超声处理后24h,各组HMC的形态
Fig.1 HMC morphology in different groups at 24h after ultrasonic treatment with different parameters (×100)1～9分别为实验1～9组,10为LPS模型组,11为对照组。

在各实验组中，细胞生长的抑制趋势与细胞形态学观察的结果基本一致。结果显示，当占空比为4∶1时(实验7、8、9组)，各组HMC生长抑制率均达到60.00%以上；当占空比为1∶4时(实验1、2、3组)，各组HMC生长抑制不明显，抑制率均小于3.00%；而当占空比为1∶1时(实验4、5、6组)，不同辐照时间和超声强度的组合对HMC生长抑制有不同的影响，抑制率分别为2.85%、14.82%和56.90%。由此可见，当占空比为1∶1时，选择合适的超声声强和辐照时间可能会满足超声联合微泡和(或)药物治疗的目的。因此，为了进一步选择超声联合微泡和或药物的合适超声参数，我们又对占空比为1∶1时不同声强和辐照时间的超声对LPS诱导HMC增殖影响进行了实验研究。

2.2占空比为1∶1时，不同声强和辐照时间的超声对LPS诱导HMC增殖的影响

2.2.1 细胞形态学变化 超声处理后24 h，各组细胞形态呈现不同的变化。与上述2.1.1项的实验结果描述相似，对照组和模型组细胞均呈不规则的多角形，但模型组细胞密度明显增加。与模型组相比，实验1～4组中的细胞形态和密度变化均不明显；而实验5和6组中的细胞形态变化较大，多角形细胞明显减少，出现较多圆形细胞，原细胞伪足消失，且细胞密度减小。其中，实验6组中细胞的形态学变化最明显，贴壁细胞密度明显低于模型组，有多数细胞漂浮于培养基上，呈死亡细胞形态。

2.2.2 细胞生长的抑制作用 选定占空比为1∶1，给予不同声强和辐照时间的超声处理LPS诱导的HMC，结果可见，当辐照时间为5 min时，随超声强度的增加，细胞生长抑制逐渐增强，但各组间的差异均无统计学意义(P>0.05)；当辐照时间为10 min时，随超声强度的增加，细胞生长抑制明显增强，且均强于相应强度的辐照5 min组，其中以实验5和6组的效应最为明显，其细胞生长抑制率分别为(22.86±4.67)%和(52.09±7.01)%，与模型组的差异均有统计学意义(P<0.05，表6)。

表4正交试验分析——不同参数的超声对LPS诱导HMC增殖生长抑制率的影响

Tab.4 Orthogonal experiment analysis—Effects of ultrasound with different parameters on the inhibition rate in LPS-induced HMC proliferative growth

组别超声占空比(A)声强(B,W/cm2)时间(C,min)抑制率(%)(1)(2)(3)均值实验1组1∶4(A1)1.48(B1)5(C1)3.912.921.872.90实验2组1∶4(A1)2.56(B2)10(C2)3.922.811.822.85实验3组1∶4(A1)2.79(B3)15(C3)1.080.75-0.170.55实验4组1∶1(A2)1.48(B1)10(C2)2.834.900.822.85实验5组1∶1(A2)2.56(B2)15(C3)60.8453.1256.7456.90实验6组1∶1(A2)2.79(B3)5(C1)12.8020.1011.5614.82实验7组4∶1(A3)1.48(B1)15(C3)81.7362.3086.9777.00实验8组4∶1(A3)2.56(B2)5(C1)70.1262.5051.1361.25实验9组4∶1(A3)2.79(B3)10(C2)91.1085.4094.2590.25K16.3082.7588.97K274.57121.0095.95K3228.50105.62134.45K1′2.1027.5826.33K2′24.8640.3331.98K3′76.1735.2144.82R74.0712.7518.49

表5正交试验的方差分析

Tab.5 Variance analysis of orthogonal experiment

方差来源离差平方和自由度均方FPA(占空比)23565.973211782.98753.9450.000B(声强)792.8872396.4431.8150.190C(时间)1848.2872924.1444.2310.030误差4150.08819218.426总和31408.50425

表6占空比为1∶1时，不同声强和辐照时间的超声对LPS诱导HMC增殖生长抑制率的影响

Tab.6 Effects of ultrasound with different intensity and exposure time on the inhibition rate in LPS-induced HMC proliferative growth at a 1∶1 duty cycle

n=3)

与模型组相比，*P<0.05。

3 讨 论

系膜细胞是肾小球内固有细胞之一。生理情况下，系膜细胞具有合成细胞外基质、调节肾小球滤过及清除免疫复合物的功能，对肾小球内部结构的维持起重要作用[12-13]。然而，在病理情况下，系膜细胞又是重要的参与者，它可以通过增殖活化及表型转化，产生多种细胞因子，介导炎症反应的发生，表现为系膜细胞的增殖与细胞外基质的过度沉积，最终导致肾小球硬化和肾小球疾病的持续进展[13-14]。因此，有效抑制系膜细胞增殖是慢性肾小球疾病防治研究的热点。

超声波是一种机械波，具备声波的所有物理特性、有良好的组织穿透性、方向的可定位性和能量在组织的沉积性[15]。利用超声波与生物组织作用后产生的热效应、空化效应和机械效应等，超声已被应用于很多疾病治疗领域[5-6]。同时，超声的空化效应不仅可使更多药物或基因释放到被超声波照射的局部组织中，还可增加血管内皮细胞膜通透性，利于药物或基因进入细胞内，实现靶向传输药物和基因，以增强药物的治疗效果、减少药物的治疗剂量[6,9-10]。近年来有学者发现，超声也具有抗炎作用，超声治疗可抑制LPS诱导的成骨细胞炎症因子释放、膝关节置换术后局部的炎症反应、烧伤局部炎症细胞的浸润和细胞因子及金属蛋白酶的表达、增加跟腱细胞抗炎细胞因子的表达和抑制弗氏佐剂诱导的关节炎等[8,16-18]。因此，超声在医学领域的应用已非常广泛，利用超声治疗慢性支气管炎、变应性鼻炎、膝关节炎等多种炎症疾病也已被陆续报道[15,19]。然而，目前尚未见超声在肾小球肾炎治疗方面的相关研究报道。

研究表明，超声治疗作用与超声参数密切相关，如占空比过大、超声强度过高或辐照时间过长都会对周围正常细胞产生过强的杀伤作用[6,20-21]。超声强度和辐照时间相同时，选择不同占空比，采用连续模式或低频低强度短脉冲，对组织和细胞的影响明显不同[5]。如果超声的声能量过小，其空化效应减弱，与脂质微泡联合应用时，不能有效促进微泡的稳定空化和惯性空化，会减弱超声的靶向作用[22]。因此，无论研究超声或超声联合微泡治疗疾病时，超声参数的选择都是至关重要的。

本研究利用LPS诱导HMC增殖细胞模型，设计超声3因素3水平正交试验，通过分析3个超声参数—占空比、超声强度和辐照时间对LPS诱导HMC增殖的抑制作用，筛选出对细胞无明显杀伤作用并可能有效促进微泡靶向爆破的超声参数。在这3个超声参数中，占空比对细胞生长抑制率的影响最大，其次为超声辐照时间和超声强度。当占空比达到4∶1时，超声对HMC的增殖生长具有明显的抑制作用，细胞形态学显示大部分细胞呈圆形，提示该参数的超声声学效应太强，可直接造成细胞死亡。当占空比为1∶4时，超声的声学效应和热效应都较弱。而当占空比为1∶1时，不同辐照时间和超声强度的组合对HMC细胞生长抑制有不同的影响，其中占空比1∶1、超声强度2.79 W/cm2、时间5 min时，HMC生长受到一定抑制，其细胞增殖抑制率为14.82%和13.43%，但与模型组的差异无统计学意义(P>0.05)，提示该参数的超声可能是下一步联合微泡和或药物治疗研究的安全超声参数。

超声抑制细胞增殖的机制与超声的机械效应、热效应及空化效应有关。它可引起细胞膜结构改变、加快细胞膜通透性、促进DNA损伤、促凋亡基因表达增强或激活某些信号通路等引起细胞凋亡甚或细胞坏死，从而抑制细胞增殖[23-26]。本研究结果显示，超声可造成细胞密度不同程度的减少，并可见死亡细胞，由此我们推测，超声抑制HMC增殖的机制可能与超声引起的细胞凋亡或细胞坏死有关。然而，这一推测及其确切的机制尚需今后进一步的研究。

超声空化效应是超声介导药物或基因递送以发挥局部靶向治疗的主要生物学机制。由于不同参数的超声产生的空化效应不同，其对联合药物和(或)微泡靶向递药的效率也会产生不同的影响。在选择合适参数的超声联合药物和(或)微泡抗肾小球肾炎治疗时，除考虑安全性问题外，尚需要结合药物递送效率的情况进行综合判断超声参数。因此，占空比1∶1、超声强度2.79 W/cm2、时间5 min的超声参数是否为下一步体外研究该频率超声联合微泡和(或)药物进行肾小球肾炎靶向治疗的最佳选择，尚需联合微泡和(或)药物开展进一步研究来验证。总之，本研究为今后超声联合微泡和或药物进行肾小球肾炎靶向治疗研究奠定了很好的实验基础。