老龄大鼠血清非对称性二甲基精氨酸浓度变化及其与心肌细胞衰老的关系

杨 凡 熊学丽

(荆门市第二人民医院心内科，湖北 荆门 448000)

心肌细胞是终末分化细胞，随着增龄不断衰老，且数量不断减少，在衰老相关性心血管疾病和心功能下降中，心肌细胞的衰老发挥着重要作用。衰老的发生发展和线粒体功能障碍、衰老相关基因的改变、氧化应激等关系密切。老年人群线粒体生物合成和数量减少，ATP生成下降，线粒体功能障碍。老年人群的衰老基因表达和活性升高，长寿基因的表达和活性下降〔1～4〕。老年人对活性氧的抑制作用下降，活性氧的生成增加，氧化损伤分子增多。一氧化氮(NO)是心血管活性物质，对心血管发挥保护作用〔5〕，非对称性二甲基精氨酸(ADMA)是一氧化氮合酶(NOS)的抑制物，抑制NO的生成〔6〕。 本文对老龄大鼠血清中ADMA水平进行研究，并探讨其与心肌细胞衰老的关系。

1 材料与方法

1.1材料 实验动物及分组：选择12只23月龄、清洁级、雄性、健康Wistar大鼠作为老年组，12只4月龄、清洁级、雄性、健康Wistar大鼠作为青年组。

1.2实验方法

1.2.1标本采集 将老年组和青年组大鼠麻醉成功后抽取颈动脉血离心，留取血清用于血清生化指标检查。处死大鼠，留取心肌组织进行RT-PCR测定。

1.2.2生化指标 取离心后血清采用高效液相色谱法测定ADMA水平；空腹血糖(FPG)采用血糖仪进行测定；血液加入氰化高铁血红蛋白测试液，分光光度计测定540 nm处光密度值，以10 g血红蛋白的吸光度表示糖化血红蛋白(HbA1c)结果；血浆胰岛素采用竞争性放射免疫分析法进行测定；总胆固醇(TC)采用固醇氧化酶-过氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法进行测定；三酰甘油(TG)采用甘油磷酸氧化酶-过氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法测定；低密度脂蛋白(LDL)采用聚乙烯硫酸沉淀法测定；高密度脂蛋白(HDL)采用磷钨酸镁沉淀法测定。

1.2.3心肌组织中二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)活性、NOS活性和NO含量测定 心肌组织中DDAH活性采用考马斯亮蓝试剂盒进行测定，取心肌组织上清和ADMA反应，以没有加ADMA反应体系者作为阴性对照组，DDAH活性值为心肌组织和ADMA反应测得的数值减去阴性对照组的数值。NOS活性按照试剂盒说明进行测定，测量管取心肌组织上清，空白管取双蒸水，每管加入底物缓冲液反应后，测量530 nm波长处的光密度值，计算NOS活性。心肌组织中NO含量采用硝酸还原酶法进行测定。

1.2.4心肌组织中P21 mRNA、P53 mRNA、Sirt1 mRNA水平测定 提取心肌组织总RNA，采用RT-PCR法测定心肌组织中P21 mRNA、P53 mRNA、Sirt1 mRNA水平，均以GAPDH为内参照，P21 mRNA、P53 mRNA、Sirt1 mRNA相对表达量为目的基因与GAPDH的相对灰度值。

1.3统计学方法 采用SPSS20.0软件行t检验、Pearson相关性分析。

2 结 果

2.1老年组和青年组血清ADMA和血糖血脂水平比较 老年组血清ADMA水平明显高于青年组(P<0.05)，FPG和胰岛素水平低于青年组(P<0.05)，血清TC、LDL水平高于青年组(P<0.05)，血清HDL水平低于青年组(P<0.05)；两组血清TG水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组血清ADMA和血糖、血脂水平比较

2.2两组心肌组织中DDAH活性、NOS活性和NO含量比较 老年组心肌组织中DDAH活性、NOS活性和NO含量低于青年组(P<0.05)，见表2。

表2 两组心肌组织中DDAH活性、NOS活性和NO含量比较

2.3两组心肌组织中P21 mRNA、P53 mRNA、Sirt1 mRNA水平比较 老年组心肌组织中P21 mRNA和P53 mRNA水平高于青年组(P<0.05)，Sirt1 mRNA水平低于青年组(P<0.05)，见表3。

表3 两组心肌组织中P21 mRNA、P53 mRNA、Sirt1 mRNA水平比较

2.4老年组血清ADMA水平和心肌组织中P21 mRNA、P53 mRNA、Sirt1 mRNA水平相关性 老年组血清ADMA水平与心肌组织中P21 mRNA、P53 mRNA水平呈正相关(r=0.692，0.681；均P<0.05)，与心肌组织中Sirt1 mRNA水平呈负相关(r=-0.562，P<0.05)。

3 讨 论

衰老是生命的基本现象，在分子水平、细胞水平、组织器官水平、整体水平等各个层次均有衰老过程的发生。细胞衰老时，和衰老有关的蛋白质含量和活性发生变化，如超氧化物歧化酶的表达和活性下降，β-半乳糖苷酶的表达和活性升高，都是细胞衰老的标志。衰老也是心血管疾病的主要危险因素，对衰老相关的心血管疾病进行研究具有重要意义。NO在衰老相关的心血管疾病的发生发展中具有重要意义，是一种内源性的血管活性物质，由eNOS催化L-精氨酸转化而来，由eNOS合成的NO在心血管系统中具有调节血管张力、介导血管内皮依赖性舒张、抑制血小板聚集、抗白细胞黏附、抗血管平滑肌细胞增殖等作用，对心血管具有保护作用；随着年龄的增加，细胞内产生的NO减少，和NO有关的功能下降〔7〕，其机制可能和内源性L-精氨酸含量下降有关。ADMA为L-精氨酸的同系物，是NOS的内源性抑制物，ADMA水平升高对eNOS合成NO具有抑制作用〔8～10〕，从而对心血管疾病的发生有促进作用；内源性ADMA多数由DDAH代谢为二甲胺和L-胍氨酸，少数经肾脏排出，因此DDAH是ADMA浓度重要的调节因子。本研究结果发现，老年大鼠血清ADMA水平升高，血糖和胰岛素水平降低，存在血脂异常，心肌组织中DDAH活性、NOS活性和NO含量降低，表明ADMA可能通过抑制NOS合成NO，降低心肌组织中NO含量，并使L-精氨酸之间电子传递脱耦联。L-精氨酸为NO和NOS合成前体，从而使O2成为受电子体，使超氧阴离子水平升高，诱导氧化应激的发生，从而和心肌细胞的衰老有关，增加心血管疾病的发生风险。

P21能够结合细胞周期蛋白依赖性激酶4和细胞周期蛋白依赖性激酶2，从而抑制两种细胞周期蛋白依赖性激酶的活性，对RB蛋白的磷酸化有阻断作用，使细胞周期停滞在G1期，从而降低细胞的增殖能力，诱导细胞的衰老；P21还能够抑制增殖细胞核抗原的活性，增殖细胞核抗原是DNA多聚酶辅助因子，引起P21能够抑制S期DNA合成，将细胞周期阻滞在G1期〔11，12〕。P53为抑癌基因，在静息状态下P53水平很低，在氧化应激、DNA损伤、渗透压休克等各种应激时P53被活化，P53能够诱发细胞凋亡、介导细胞生长阻滞、活化DNA修复蛋白，从而抑制肿瘤的发生，在细胞衰老过程中，P53蛋白的体内转录活性和体外DNA结合活性增加，可能通过和DNA结合诱导P21表达，介导细胞周期阻滞在G1期，从而发挥阻止细胞生长的作用〔13，14〕。Sirt1为长寿基因，在生物体衰老过程中发挥重要作用。Sirt1通过对其他蛋白、转录因子、组蛋白的赖氨酸残基进行去乙酰化，对基因的表达进行调节，发挥复制性衰老，调节细胞寿命等功能〔15，16〕。本研究结果发现，ADMA促进心肌细胞衰老的机制可能和心肌组织中P21 、P53、Sirt1的表达水平有关，心肌组织中P21和P53水平升高，使心肌细胞周期阻滞在G1期，从而诱导心肌细胞衰老；心肌组织中Sirt1水平降低，使心肌细胞的寿命减少，从而促进心肌细胞的衰老。