肉苁蓉多糖对D-半乳糖致衰小鼠脑神经细胞的保护作用及机制

蔡克瑞 刘志新 孙晓冬 闫 磊

(牡丹江医学院组胚教研室，黑龙江 牡丹江 157011)

肉苁蓉为国家二级保护植物，含多种活性成分，多糖是其主要活性成分之一。肉苁蓉及其有效成分具有抗疲劳、抗衰老、抗肿瘤、增强机体免疫力等药理作用，但有关肉苁蓉多糖对衰老小鼠脑神经细胞保护作用的研究尚未见报道。本实验拟探讨肉苁蓉多糖对衰老小鼠脑神经细胞的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1材料 昆明种小鼠60只，雌雄各半(牡丹江医学院实验动物中心提供)。D-半乳糖(上海试剂二厂)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒(南京建成生物工程研究所)；细胞凋亡、Bcl-2、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(武汉博士德生物制品有限公司)；TritonX-100、二甲基亚砜、胰蛋白酶(华舜生物工程有限公司)；Scout-Ⅱ半自动生化分析仪；R201D旋转蒸发仪；真空泵，恒压稳流电泳仪，生化培养箱，OLYMPUS荧光显微镜。

1.2方法

1.2.1肉苁蓉多糖的制备 肉苁蓉生药片，经热乙醇浸泡3 h后，纱布过滤后弃滤液。药渣加水煎煮3次，每次1～2 h，过滤后合并滤液。蒸发浓缩后离心去沉淀，上清液加2～3倍体积的95%乙醇沉淀，4℃静置24 h，次日4℃ 6 000 r/min离心20 min收集沉淀。沉淀经水复溶、脱蛋白透析、冷冻干燥后获粗多糖。

1.2.2D-半乳糖致衰小鼠模型的建立 60只昆明种小鼠随机分为青年对照组，衰老模型组，肉苁蓉多糖组，每组20只。衰老模型组和肉苁蓉多糖组每日上午颈背部皮下注射D-半乳糖100 mg/kg，连续30 d。青年对照组每日颈背部皮下注射相同剂量的生理盐水。每天皮下注射的同时灌胃给药，肉苁蓉多糖组灌服肉苁蓉多糖(折合生药0.01 g/ml)，青年对照组和衰老模型组每日灌胃相同剂量的蒸馏水，连续30 d。

1.2.3动物处理及指标测定 30 d后所有小鼠断头处死，立即取出脑组织，取大脑中部中性甲醛固定。余下脑组织一部分用生理盐水制成匀浆，一部分用胰蛋白酶消化制成单细胞悬液。

取脑组织匀浆，按SOD、MDA、GSH-Px试剂盒说明书操作，用半自动生化分析仪比色分析测定结果。DNA的损伤率采用单细胞凝胶电泳法即彗星实验检测；TUNEL法观察神经细胞凋亡数；免疫组化法检测Bcl-2基因表达。

1.3统计学处理 用SPSS16.0软件行q检验。

2 结 果

2.1肉苁蓉多糖对小鼠脑SOD、MDA、GSH-Px、DNA损伤率和细胞凋亡的影响 灌服肉苁蓉多糖可提高致衰小鼠SOD活性、GSH-Px活力，降低MDA含量，增强神经细胞DNA损伤的修复能力，减少凋亡细胞数。见表1，图1～3。

表1 肉苁蓉多糖对D-半乳糖致衰小鼠脑神经细胞的影响

与青年对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与衰老模型组比较：3)P<0.01

图1 小鼠脑组织HE染色(×100)

图2 衰老模型组脑神经细胞凋亡(×400)

图3 肉苁蓉多糖组脑神经细胞凋亡(×400)

2.2肉苁蓉多糖对脑组织Bcl-2表达强度的影响 青年对照组脑组织Bcl-2阳性表达18例，衰老模型组为4例，肉苁蓉多糖组为16例，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。肉苁蓉多糖可增强D-半乳糖致衰小鼠脑神经细胞Bcl-2表达强度。见图4。

图4 衰老模型组和肉苁蓉多糖组脑组织Bcl-2表达(免疫组化法)

3 讨 论

衰老自由基学说认为人类随年龄增长的退行性变化是由自由基活性氧化损伤作用所致。D-半乳糖致亚急性中毒状态下，体内产生大量超氧阴离子自由基，对组织产生过氧化损害，这种生化和组织结构的改变与自然衰老表现基本吻合。有研究发现，细胞程序性死亡对衰老起主动作用，并引起特征性形态改变及衰老性生长停滞，衰老细胞死亡的实质就是细胞凋亡〔1〕。Bcl-2家族蛋白在调控神经细胞凋亡和生存中发挥重要作用，家族成员包括促凋亡基因和抑制凋亡基因，抑制细胞凋亡的基因主要有Bcl-2、Bcl-xl等。Bcl-2基因是一种原癌基因，具有抑制细胞凋亡的作用〔2，3〕。Bcl-2的过度表达可减少神经元程序性细胞死亡，引起特定脑区内神经元数目增多。

肉苁蓉又名金笋、地精，为列当科植物肉苁蓉或管花肉苁蓉的干燥带鳞叶的肉质茎，主产于内蒙古、甘肃、新疆、青海等地；性温、味甘咸，为补肾壮阳、润肠通便之要药，有“沙漠人参”的美誉，《中国药典》2010年版收录的肉苁蓉和管花肉苁蓉为正品药材〔4，5〕。现代药理研究也证明肉苁蓉除具有补肾壮阳、润肠通便作用外，还具有抗疲劳、抗衰老、增强机体免疫力及增强记忆力等作用。吴波等〔6〕研究发现肉苁蓉总苷能明显提高亚急性衰老小鼠抗氧化及延缓衰老的作用；尹刚等〔7〕研究发现肉苁蓉多糖通过调控抗凋亡基因表达水平抑制大鼠海马区神经元的凋亡，这与本实验观察到的结果相似。本实验结果显示灌服肉苁蓉多糖后，衰老小鼠各项衰老指标得以改善，其原因与以下因素有关：①肉苁蓉多糖作为一种功效显著的天然抗氧化剂，可清除超氧自由基、羟自由基、单线态氧等多种自由基及其代谢产物，使SOD的消耗减少、活性上升，MDA含量下降。②肉苁蓉多糖中含有多种人体必需的微量元素，能提高DNA损伤的修复能力。③肉苁蓉多糖有促进代谢、调节基因表达的作用，上调Bcl-2基因表达水平，通过Bcl-2发挥其抗氧化作用，可减少氧自由基产生和脂质过氧化物的形成，减少体内自由基积聚引起的一系列连锁反应，减少DNA氧化损伤，抑制氧化应激诱导的细胞凋亡的发生，对脑神经细胞起到保护作用。

综上，肉苁蓉多糖具有改善衰老小鼠脑神经细胞损伤的作用，这种作用与其抗氧化、抗凋亡及上调Bcl-2表达水平有关，但Bcl-2表达与激活途径的具体机制及与抗氧化、抗凋亡之间的关系还不清楚，将在进一步的实验中深入研究。