二代测序技术筛查肥厚型心肌病伴房颤家系致病基因研究

杜 媛，罗 玲，王 娅，韩 秀，韩 克，马爱群

(西安交通大学第一附属医院心血管内科，陕西省分子心脏病学重点实验室，环境与疾病相关教育部重点实验室，陕西西安 710061)

肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy, HCM)是一种心肌肌小节蛋白基因突变的常染色体显性遗传性疾病，以心室肌肥厚(尤其是室间隔非对称性肥厚)为特征，常表现为心律失常、运动耐量受损及猝死，是儿童和青少年猝死的常见原因之一[1]。流行病学研究显示，普通人群中HCM的发病率至少为0.2%，其中50%以上的患者具有明显的家族聚集倾向，表型呈现出多样性，且同一家族亦有较大异质性[2]。迄今已确定至少30个基因的1 500多种突变与家族性HCM相关[3-4]。然而，绝大多数新诊断HCM患者或家系的遗传背景仍不明确，如何高效、快捷地确定其突变基因对于患者的诊疗尤为重要。基因检测有助于HCM的早期诊断，但一代测序技术存在检出率低、成本高等不足。近年来，二代测序技术(next-generation sequencing, NGS)以其高通量、高效、价廉等特点促进了遗传性疾病的致病基因筛查研究[5-6]。本研究拟应用NGS技术结合Sanger测序法对1个HCM伴房颤家系进行分析，探讨可能的遗传背景。

1 对象与方法

1.1研究对象入选2015年2月就诊于西安交通大学第一附属医院的HCM伴房颤先证者及其家系成员共14例。HCM诊断参照2014年欧洲心脏病学会(ESC)HCM诊断与治疗指南[3,7]，包括心动超声显示舒张末期心室某一节段或者多个节段室壁厚度≥15 mm，或间隔与后壁的室壁厚度比值>1.3，除外高血压等引起继发性心肌肥厚的因素及其他心血管系统疾病。收集入选者包括一般查体、心电图和超声心动图等临床资料。对照为100例正常健康志愿者，各项检查均未见异常。本研究经西安交通大学第一附属医院伦理委员会批准，所有入选者均签署知情同意书。

1.2HCM捕获芯片设计该捕获芯片包含168个与HCM相关的基因。捕获探针由美国Agilent公司设计，覆盖上述基因的全部外显子区域及相邻内含子区域(50 bp)。

1.3遗传基因筛查提取先证者外周血基因组DNA，构建DNA文库，以目标序列捕获联合NGS技术的方法进行基因检测。筛选获得的遗传变异均通过Sanger测序法进行验证。

1.4生物信息分析采用SIFT、PolyPhen2、Mutation Taster等软件预测单核苷酸改变对蛋白功能的影响。

2 结 果

2.1患者家系一般临床情况该家系中先证者为59岁女性(Ⅱ-2)，于2年前被诊断为HCM(图1A)。患者有阵发性心悸、劳累性呼吸困难及胸痛的症状，NYHA心功能分级为Ⅱ级，无眩晕、晕厥等不适；无高血压、糖尿病等其他心血管疾病。心动超声提示不对称性心肌肥厚，室间隔最大厚度15 mm，左室后壁厚度9 mm，收缩期二尖瓣前移征象(SAM征)阴性，左房前后径30 mm，左室舒张末期前后径48 mm，射血分数(EF)61%。心电图示窦性心律、左室肥厚(图1B)，心率为50次/min，这可能与患者长期服用美托洛尔有关。患者诉曾行动态心电图发现阵发性心房颤动(资料未提供)。

图1家系图及先证者心电图

Fig.1 Pedigree of the family and the proband’s ECG

A：家系图；B：先证者心电图。

先证者父亲(Ⅰ-1)有多年的活动后气短病史。9年前因房颤伴Ⅲ度房室传导阻滞植入永久VVI起搏器，当时心脏情况不详(未能提供资料)。此次访视心动超声显示左室心腔明显扩大，心脏收缩功能轻度下降(EF 45%)，室间隔厚度正常范围(表1)。

先证者母亲无临床症状，既往有高血压病史，经药物控制血压良好。心动超声示左房、左室轻度扩大，未见心肌肥厚。其心电图为完全性右束支传导阻滞。

先证者的二妹(Ⅱ-6)有明显气短、胸痛病史，NYHA心功能分级为Ⅱ级。其心电图示心房颤动和左室肥厚。心动超声显示明显的室间隔肥厚，二尖瓣轻度反流，可见SAM征，安静状态下左室流出道压力阶差为40 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，行Valsalva动作后该值升至65 mmHg。

先证者的三妹(Ⅱ-8)于5年前被诊断为风湿性心脏瓣膜病。此次访视心动超声显示二尖瓣重度狭窄伴轻度反流，左房巨大(LA 70 mm)。该患者有长期的气短病史，但拒绝行换瓣手术。

先证者的女儿(Ⅲ-2)和外甥(Ⅲ-4)曾在外院行心动超声检查后诊断为HCM，但2人均无相应临床表现，心电图为窦性心律。家系内其余亲属平素无临床症状，其心电图和心动超声均正常。

表1家系成员临床特征

Tab.1 Clinical characteristics of the family members

家系成员ID年龄/性别心动超声LAD (mm)LVEDD(mm)IVST(mm)LVPWT(mm)LVEF(%)心电图症状PRDM16基因Ⅰ-178/M586810845AF、Ⅲ度AVB、起搏器植入心悸、心绞痛、呼吸困难-Ⅰ-279/F36539866窦性节律、RBBB无-Ⅱ-259/F325115961阵发性AF呼吸困难p.G1042RⅡ-453/F31488865窦性节律无-Ⅱ-648/F374125966AF心绞痛、呼吸困难p.G1042RⅡ-842/F70568868AF呼吸困难p.G1042RⅡ-941/M32508864窦性节律无-Ⅲ-133/F28487871窦性节律无-Ⅲ-228/F294714869窦性节律无p.G1042RⅢ-326/M30499972窦性节律无-Ⅲ-422/M334216967窦性节律无p.G1042RⅢ-517/M28478871窦性节律无-Ⅲ-612/F25446675窦性节律无-Ⅲ-716/M27477773窦性节律无-

LAD：左心房直径；LVEDD：左心室舒张末期内径；IVST：舒张期末室间隔厚度；LVPWT：左心室后壁厚度；LVEF：左心室射血分数；AF：房颤；AVB：房室传导阻滞； RBBB：右束支传导阻滞。M：男性；F：女性。

2.2基因测序结果二代测序结果显示先证者携带PRDM16基因c.3124G>A杂合突变，该错义突变c.3124G>A突变位于PRDM16基因第14个外显子，导致编码的1 042位甘氨酸(Gly)突变为精氨酸(Arg)，即p.G1042R(图2A)。Sanger测序发现先证者的2个妹妹(Ⅱ-6和Ⅱ-8)以及先证者的女儿和外甥(Ⅲ-2和Ⅲ-4)均携带该突变，家系中其他成员及100例健康个体中未发现该突变。先证者父母亲均未携带该突变，考虑该突变为新生突变。此外，氨基酸序列分析显示PRDM16蛋白1042位点所对应的氨基酸在不同物种之间具有保守性(图2B)，提示该位点突变后的重要性。

2.3生物信息学分析PRDM16基因c.3124G>A突变导致1042位点氨基酸由甘氨酸突变为精氨酸，导致突变体较野生型体积增大，由突变前不带电变为突变后带正电氨基酸残基。此外，突变点位于SKI作用区以及转化生长因子(TGF)-β调节区，突变后可能会导致蛋白质功能的异常。该突变在HGMD数据库中未见报道，采用多种生物信息学软件预测发现PRDM16基因c.3124G>A(p.G1042R)突变可能为有害突变，主要通过影响蛋白功能而致病(表2)。

3 讨 论

HCM是一种有多种临床和基因表现的复杂性疾病，本研究采用二代基因测序发现1个HCM伴房颤的家系中存在PRDM16基因突变(c.3124G>A[p.G1042R])，生物信息学预测提示该突变可能是新的致病基因。

PRDM16基因位于染色体1p36.32，编码PR结构域锌指蛋白(PR domain zinc finger protein 16, PRDM16蛋白)[8]。在胎儿和成年人心脏中，PRDM16位于心肌细胞和间质细胞的细胞核，有助于维持哺乳动物异染色质和核纤层结构的完整性[9]，而PRDM16突变小鼠有明显的心室发育不全[10]。目前，已有报道PRDM16突变可能与家族性扩张型心肌病及左心室致密化不全有关[11]，但HCM中尚未见PRDM16基因异常报道。本研究发现的PRDM16-p.G1042R突变经多种生物信息学软件分析，提示该突变通过影响蛋白功能而致病，可能为有害突变。但该突变位点具体如何影响PRDM16蛋白的功能、进而导致HCM，尚需要进

图2PRDM16p.G1042R杂合突变位于保守区

Fig.2 Heterozygous mutation p.G1042R of PRDM16 located in the conservation area

A：电泳图显示3 124位点碱基由G杂合突变为A(c.3124G>A)，导致1 042位点氨基酸由甘氨酸突变为精氨酸(p.G1042R)；B：序列比对显示PRDM16蛋白第1 042位点氨基酸(红色)为保守位点。

表2生物信息学软件预测PRDM16-G1042R突变的致病性结果

Tab.2 Pathogenic effect of PRDM16-G1042R mutation predicted by bioinformatics software

预测软件预测结果积分备 注PolyPhen-2最可能有害0.999从0.000(最可能良性)到1.000(最可能有害)PROVEAN有害-3.157预设值为-2.5,≤-2.5(有害),>-2.5(中性)SIFT影响蛋白功能0.010范围0～1,≤0.05(有害),>0.05(可耐受)MutationTaster致病基因0.999可能性接近1提示预测价值高

一步研究确认。研究发现PRDM16突变可导致心脏收缩功能不全、心肌细胞部分解耦联以及心肌增殖能力受损[11]。体内激活或抑制PRDM16活性可破坏细胞增殖和分化之间的微妙平衡[10]。PRDM16相关性心肌病的基础机制为心脏发生过程中心肌细胞增殖能力受损，后者与TGF-β信号通路有关[10]。

本研究中的家系内，数个携带有PRDM16-p.G1042R突变的家庭成员合并有房颤病史，因此，同时检测了30多个与家族性房颤相关的基因，但均无阳性发现。据此推测房颤继发于HCM。既往国外报道约20% HCM患者合并房颤[12]，我国伍熙等学者报道梗阻性HCM患者中合并房颤的比例为17.5%[13-14]。与HCM相关的解剖及生理学改变包括：心脏舒张功能下降、心肌缺血及心肌自律性紊乱等均可促进房颤的发生、发展[15]。

本研究中先证者及其2个妹妹均携带PRDM16-p.G1042R突变，且其女儿及外甥也携带该突变，但其父母及100例健康对照均未检测到，考虑该突变可能为新生突变[16]。由于先证者及其2个妹妹均携带该突变，故推测对于先证者父亲或母亲来说，PRDM16应该是一个生殖细胞嵌合体，突变只存在于生殖细胞，体细胞中不携带，故该突变可遗传给下一代，而在父母亲的外周血中不能检测到。

本研究家系中PRDM16-p.G1042R突变的外显率是80%(5个突变携带者中有4个可诊断为HCM)。先证者的三妹(Ⅱ-8)携带该突变，但心动超声未见HCM，而是风湿性瓣膜病表现，其原因可能是该患者虽为基因携带者，但无HCM表型表达，也可能是后天的风湿性瓣膜病引起的血流动力学异常所导致的心脏结构改变而掩盖了HCM的表现。多种因素决定着基因的外显率和表现度，遗传学病因、背景修饰基因以及血流动力学等相互作用共同促成表型的发展[17-18]。因此，详细的临床评估及基因检测有助于识别那些无表型表达的突变携带者。此外，因为新生突变的缘故，对于那些没有HCM家族史的个体或散发患者也应进行基因筛查。因此，2014年ESCHCM诊断和管理指南推荐对满足HCM诊断标准的患者应进行遗传检测，以帮助对其亲属进行逐层遗传筛查[3]。

综上，本研究在1个HCM伴房颤的家系中发现PRDM16-p.G1042R杂合突变，该突变所在区域在不同种系间高度保守，经生物信息学软件预测该突变可能通过影响蛋白功能而致病，提示该突变位点可能是该HCM家系的致病基因。