DEN和NMOR联合诱导F344大鼠肝癌形成过程中SERPINB5的表达变化

孙海凤，赵兴宇，经 里，郭亚焕，雷宝霞，陈文娟，赵 征，南克俊，杨广宁

(1. 陕西省肿瘤医院肿瘤内科，陕西西安 710061；2. 西安交通大学医学部临床医学系，陕西西安 710061；3. 兵器工业521医院耳鼻咽喉科，陕西西安 710061；4. 西安交通大学医学部第一附属医院肿瘤内科，陕西西安 710061；5. 陕西省肿瘤医院微创介入科，陕西西安 710061)

最新流行病学统计资料显示，中国原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的新发病例466 100例，居恶性肿瘤的第4位，死亡病例422 100例，居第3位，而美国新发病例40 710例，死亡病例28 920例[1-2]。由于肝癌发展迅速，缺乏有效的治疗手段，5年生存率不足5%，预后极差。虽然分子靶向药物已成为治疗肝癌的重要手段，但其有效率仍然较低[3]。因此，寻找肝癌早期诊断的新分子标记、新治疗方法或分子靶点尤为必要。

众所周知，肝癌的发生、发展有众多因素参与，如霉变食物、病毒性肝炎及黄曲霉毒素等[4-5]，且从肝细胞炎性改变、肝细胞纤维化和萎缩、肝细胞不典型增生及肝细胞癌变的多步骤病理过程中，有多种癌基因的激活和抑癌基因的失活。研究证实，在抑制肿瘤细胞增殖、分化和侵袭等分子机制中，SERPINB5(serpin family B member 5)具有重要的生物学意义，如调节细胞间的粘附，促进凋亡，阻滞细胞周期，抑制细胞的增殖、侵袭、转移及血管生成作用[6-10]。

大量研究证实，化学药物联合诱导的大鼠HCC模型与人类HCC发生、发展过程相似，因而化学药物联合诱导的大鼠HCC模型对于开展人类HCC研究有着重要的临床意义[11-14]。本研究采用二乙基亚硝胺(diethylnirtosamine, DEN)和亚硝基吗啉(N-nitrosomorpholine, NMOR)复合化学法诱导F344大鼠HCC模型，对SERPINB5在大鼠HCC形成过程中的蛋白表达进行检测，分析其与HCC发生、发展的关系，为HCC的临床诊治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1主要试剂实验DEN和NMOR购自美国Sigma公司，小鼠抗人SERPINB5购自Protein tech公司，羊抗鼠二抗SP免疫组化试剂盒和DAB显色液购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2大鼠HCC模型的建立、分组及取材SPF级F344大鼠80只，雄性，6～8周龄、体质量150～200 g，购自西安交通大学医学部实验动物中心。自由饮食和饮水，室温(26±1)℃，湿度50%～55%，适应环境1周后开始实验。全部大鼠随机分为化学诱癌组(50只)和对照组(30只)。将DEN和NMOR溶解于生理盐水溶液中，实验组大鼠称重后，DEN按100 mg/kg采用腹腔注射法给药，第2天开始给予0.1 mg/kg NMOR灌胃至20周。正常对照组只在第1天按体质量给予和DEN溶液相同体积的生理盐水腹腔注射，第2天给予NMOR相同体积的生理盐水灌胃，第3天以后自由饮食和饮水。观察大鼠的精神、食欲状态、背毛及体质量改变等。在首次腹腔注射DEN后的第4、8、12、16、20周，分别从实验组和对照组随机处死大鼠10只和6只。开腹观察肝脏大体形态包括大小、质地和颜色并取材进行后续实验。

1.3组织病理学观察分别取化学诱癌组及对照组各时间点肝组织，40 g/L多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋切片，苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察肝组织的病理形态变化。

1.4免疫组织化学检测SERPINB5表达石蜡切片烘烤脱蜡，脱水后用柠檬酸修复液进行高压抗原修复。加30 mL/L H2O2在标本上作用10 min以完全去除内源性过氧化物酶，然后孵育一抗SERPINB5(11722-1-AP，1∶100，protein tech)，同时制作PBS作为阴性对照，放置4 ℃冰箱过夜。在室温条件下，二抗孵育1 h。用DAB底物显示免疫反应产物，苏木素对胞核进行复染，透明后中性树胶封片。结果判读由我院病理科两名主治以上医师进行，在普通显微镜下对10个随机视野中阳性细胞数的染色强度分级如下，0：无染色；1：弱表达染色；2：中度表达染色；3：强表达染色。阳性细胞的百分比所得分数分级如下，1：<25%；2：26%～50%；3：51%～75%；4：>76%。将上述两种评分值相加。根据总分值，样本被分为4组，阴性组(-)：被染色的细胞在总细胞数中≤5%，0分；低表达组(+)：1～3分；中等表达组()：4～5分；高表达组()：6～7分。在这些分组中，阴性组和低表达组被判定为该蛋白阴性表达，中等表达组和高表达组被判定为该蛋白阳性表达。选取阳性区域照相和灰度分析。

1.5统计学处理采用SPSS 23.0软件进行统计分析。统计结果以均数±标准差表示，采用单因素方差分析进行组间比较，并行方差齐性检验和正态性检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1F344大鼠一般状态50只化学诱癌组大鼠在第6周时出现食欲减退、背毛粗糙、神情倦怠、精神萎靡、反应迟缓、体质量下降，上述情况均逐渐加重，对照组30只大鼠几乎无上述症状，且实验组和对照组均无死亡，总死亡率为0(0/80)。

2.2F344大鼠不同阶段肝脏病理形态学改变在诱癌第4周时，肉眼可见肝脏大小与正常对照组无差异，大小正常，颜色红润，但质地略韧(图1A)；光镜下观察，肝细胞表面绒毛变平，肝窦内皮细胞下基底膜形成，内皮细胞上窗孔变小，数量稍减少(图2A)。在诱癌第8周时，肉眼可见肝脏稍肿大，颜色变深红，质地韧；光镜下观察，肝细胞表面绒毛变平，肝窦内皮细胞下基底膜形成，内皮细胞上窗孔变小，数量减少，甚至消失。第12周时，肉眼可见肝脏肿大，颜色进一步深红，质地略硬，表面出现微结节，灰白色，大小2～4 mm(图1B)；光镜下观察，可见肝脏正常小叶结构消失，肝细胞排列紊乱，出现脂肪变性和较多的炎性细胞浸润，肝脏呈典型的炎性表现(图2B)。第16周时，肉眼可见肝脏稍缩小，颜色变为暗红色，质地硬，表面微结节明显增大，直径在5～20 mm不等，与周围组织分界不清(图1C)；光镜下观察，见癌细胞微浸润，癌周肝组织假小叶多见并有明显纤维组织增生，呈现典型的肝硬化表现(图2C)。第20周时，肉眼可见肝脏缩小，颜色呈黑褐色，质地坚硬，癌结节较前增大和增多，部分融合(图1D)；光镜下可见肝细胞排列紊乱，失去正常条索状结构，细胞核比例增大，染色深，核质比例增大，可见瘤巨细胞和病理性核分裂相，其间大量炎症细胞浸润，呈典型肝癌表现(图2D)。

图1F344大鼠不同阶段肝脏的大体标本

Fig.1 Gross liver specimen in F344 rats at different stages

A：正常对照组4周；B：诱癌组12周；C：诱癌组16周；D：诱癌组20周。

图2F344大鼠不同阶段肝脏的组织形态

Fig.2 Histology of liver tissue in F344 rats at different stages (×100)

A：正常对照组4周；B：诱癌组12周；C：诱癌组16周；D：诱癌组20周。

2.3F344大鼠不同阶段肝组织内SERPINB5蛋白表达的变化蛋白阳性的样本行图像分析，测其灰度值作为其表达强度的量化指标，灰度值与实际表达强度成反比，即灰度值越低，阳性表达越强，灰度值越高，阳性表达越弱(图3)。正常对照组大鼠肝组织内SERPINB5主要表达于胞质，呈棕色，细胞膜和细胞核未见阳性表达(图4A)；诱癌组第12周时，呈典型的炎性改变，且SERPINB5的表达在胞质呈淡棕色，SERPINB5表达与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05，图4B)；诱癌组第16周时，呈典型的肝硬化表现，并伴有癌细胞微浸润，此时，相应可见细胞质SERPINB5表达大量减少，呈黄色着色，明显低于诱癌第12周(P<0.05，图4C)；诱癌组第20周时，细胞的异型性更加明显，且癌细胞大量浸润，细胞质SERPINB5表达进一步大量减少，胞质呈淡黄色着色，与诱癌第16周比较，差异有统计学意义(P<0.05，图4D)。

图3F344大鼠不同阶段肝组织内SERPINB5蛋白灰度值的变化

3 讨 论

大多数亚洲地区的原发性HCC是建立在病毒性肝炎基础之上，而欧美国家的HCC是以酒精性肝炎或脂肪性肝炎为发病原因，因此针对不同的病因，世界各地的研究者采用不同的肝癌动物模型来研究肝癌的发生、发展、侵袭、转移、预后、诊断及治疗等。本课题组已在先前的实验中，通过联合应用DEN+NMOR诱导成功建立了具有一定转移潜能的大鼠肝癌动物模型[15]。该模型操作简便、成瘤周期短、效果确切，能大批量诱发出相对稳定的肝脏肿瘤，并有一定的肺转移率，病理过程遵循损伤、炎症、硬化和肝癌发生、发展、转移的一般规律，与人肝癌生物学特性相似。在本实验中，我们同样观察到上述类似结果，说明该模型的稳定性和重复性较好，是研究人类肝癌发生、发展、转移及复发的一种较好的动物模型。

SERPINB5也称maspin，是1994年ZOU等使用消减杂交法和差异显示分析技术，在对正常乳腺和乳腺癌组织比较时发现的候选肿瘤抑制蛋白。

图4F344大鼠不同阶段肝组织内SERPINB5蛋白的表达情况

Fig.4 Expression of SERPINB5 protein in liver tissues of F344 rats at different stages (×100)

A：正常对照组4周；B：诱癌组12周；C：诱癌组16周；D：诱癌组20周。

该蛋白有一个活性位点环位于C端附近，N端可以辨别靶蛋白，启动子区含有各种转录因子结合位点，其中C端易受影响，若发生肽键断裂，就会影响SERPINB5蛋白发挥各种有效的生物学功能[16]。研究发现，SERPINB5的亚细胞定位与患者的预后密切相关，在乳腺癌和卵巢癌中研究的最多，提示SERPINB5在细胞核中表达的患者预后较好，而在细胞质中表达的患者则预后较差[17-19]。近期有学者通过多个在线数据库进行了系统Meta分析和生物信息学分析发现，SERPINB5的表达水平与胃癌患者的浸润深度、TNM分期、分化程度、肠型癌、弥漫型癌及总生存期均呈负相关[20]。上述研究结果与本课题组前期对人肝癌标本的研究结果一致[21]。

在本实验中，通过免疫组织化学法观察发现，SERPINB5几乎均表达于大鼠肝脏的胞质中，且随着肝组织在炎症、肝硬化及肝癌的病理变化进展中，其表达逐渐减少,这与本课题前期在人肝脏组织标本中研究结果一致。由此可见，我们推测SERPINB5可能与肝癌的发生、发展密切相关，其可能是肝癌早期诊断的一个新分子标记或是肝癌治疗的新靶点。当然，这种推测还需要大量的临床实践研究来支持和验证。本研究为SERPINB5在肝癌的早期诊断和治疗方面奠定了一定的实验基础。