胡桃醌通过调节Wnt/β-catenin/Snail通路抑制前列腺癌细胞上皮-间充质转化*

赵良中， 崔家博， 马 静， 王立国， 方 芳△

(吉林医药学院 1检验学院, 2附属医院， 吉林 吉林 132013)

我国前列腺癌的发病率近年来呈快速上升趋势。晚期前列腺癌会发生局部淋巴结和远处器官的转移，治疗效果差。减少前列腺癌转移的发生率在前列腺癌治疗过程中非常重要。上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)被认为是肿瘤转移的关键启动步骤。有效抑制EMT可以抑制肿瘤转移和侵袭的发生[1-2]。

胡桃醌(juglone)是从核桃楸中提纯的一种天然成分，其具有细胞毒作用，能够诱导多种肿瘤细胞发生凋亡[3-5]。最新研究也表明，胡桃醌具有抑制胰腺癌和卵巢癌细胞侵袭的作用[6-7]。但胡桃醌是否能抑制前列腺癌细胞转移和EMT及机制还不清楚。本文通过胡桃醌作用前列腺癌细胞，分析胡桃醌对前列腺癌细胞转移和EMT的作用，揭示其作用机制，为前列腺癌的治疗提供新的理论依据。

材 料 和 方 法

1 材料和主要试剂

人前列腺癌LNCaP细胞购自上海中国科学院细胞库。胡桃醌购自Sigma；RPMI-1640培养液购自Gibco；胎牛血清(fetal calf serum，FCS)购自HyClone；兔抗上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、β-连环蛋白(β-catenin)、Snail、β-actin 抗体和Wnt通路激活剂LiCl购自Cell Signaling Technology；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒购自碧云天生物科技有限公司。

2 方法

2.1细胞培养 人前列腺癌细胞LNCaP于37 ℃、5% CO2培养箱中，用RPMI-1640完全培养基(含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素)培养，隔日换液。

2.2细胞活力的检测 采用MTT比色法，取对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×108/L，体积为200 μL，接种于96 孔板内，于37 ℃、5% CO2条件培养。加入不同浓度(6.25、12.5、25、50和100 μmol/L)胡桃醌培养液，每组设3 复孔，同时设立正常对照组。体外培养24 h后MTT法测定吸光度(A)值，实验重复3次，计算细胞存活率：存活率(%)=实验组平均A值/对照组平均A值×100%。

2.3Transwell侵袭实验 取对数生长期的LNCaP细胞，将200 μL含2×104个细胞的培养液(含0.2%血清)加入到Matrigel包被的Transwell上室，分别加入0、12.5和25 μmol/L胡桃醌，下室加入含10%小牛血清的RPMI-1640培养液500 μL，培养24 h。随后取出小室，用冰上预冷的PBS 洗涤3 次去除残余培养基，用湿棉签擦去小室上层未穿过的细胞，4%多聚甲醛固定20 min 之后，室温晾干。进一步使用结晶紫染色20 min。随后用冰上预冷的PBS洗涤3 次，置于倒置显微镜下观察穿过膜的细胞数。

2.4Western blot实验 取对数生长期的LNAaP细胞，分别加入0、12.5和25 μmol/L的胡桃醌作用细胞24 h。加入细胞裂解液，用细胞刮器刮取细胞，4 ℃超声裂解细胞，4 ℃、12 000×g离心5 min，提取细胞总蛋白，收集上清液测蛋白浓度。根据说明书提取细胞核蛋白，测蛋白浓度。取30 μg 蛋白进行SDS-PAGE，将凝胶上蛋白移至醋酸纤维素膜，于50 g/L 脱脂奶粉中4 ℃封闭过夜，加兔抗E-cadherin(1∶1 000)、vimentin(1∶1 000)、Snail(1∶1 000)、β-catenin(1∶1 000)和β-actin 抗体(1∶3 000)，4 ℃过夜。次日，TBST 洗膜，分别加HRP 标记的山羊抗兔抗体(1∶3 000)室温避光孵育2 h。TBST 洗膜，加底物发光显影。使用Quantity One 软件扫描并做灰度分析。

2.5LiCl和胡桃醌联合处理细胞 采用Wnt通路激活剂LiCl(5 μmol/L)处理细胞3 h，再加入25 μmol/L胡桃醌作用细胞24 h，然后利用Western blot法测Snail和E-cadherin的蛋白表达。

3 统计学处理

统计学处理数据采用SPSS 17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差(mean±SD)表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 胡桃醌抑制LNCaP细胞的活力

不同浓度胡桃醌处理LNCaP细胞24 h 后，与对照组LNCaP细胞存活率100%进行比较，6.25、12.5、25、50和100 μmol/L胡桃醌作用细胞的存活率分别为(92.9±5.8)%、(79.2±2.1)%、(62.2±1.2)%、(39.1±3.1)%和(19.5±1.9)%,计算IC50值为35.89 μmol/L。实验结果表明，胡桃醌对前列腺癌LNCaP细胞具有细胞毒作用。为了避免高浓度胡桃醌导致细胞大量死亡，影响后续的实验结果,我们选择了12.5 μmol/L和25 μmol/L胡桃醌作用细胞。

2 胡桃醌抑制LNCaP细胞的侵袭能力

Transwell小室实验结果显示，与对照组比较，12.5和25 μmol/L胡桃醌可显著抑制前列腺癌LNCaP细胞的侵袭能力(P<0.01)，见图1。

3 胡桃醌抑制LNCaP细胞EMT

Western blot法检测EMT标志物E-cadherin和vimentin的表达。结果表明，与对照组比较，12.5和25 μmol/L胡桃醌组的E-cadherin蛋白表达量增高，25 μmol/L 胡桃醌组的vimentin蛋白表达量下降(P<0.05或P<0.01),见图2。这一结果提示，胡桃醌可能具有逆转前列腺癌细胞EMT的作用。

Figure 1.The invasion ability of the LNCaP cells treated with juglone at different doses (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

图1胡桃醌对LNCaP细胞侵袭能力的影响

Figure 2.The protein expression of E-cadherin and vimentin in the LNCaP cells treated with juglone at different doses. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

图2胡桃醌对LNCaP细胞E-cadherin和vimentin蛋白表达的影响

4 胡桃醌抑制Wnt/β-catenin信号途径

与对照组比较，12.5和25 μmol/L胡桃醌组β-catenin和Snail蛋白表达降低(P<0.05或P<0.01),见图3。与25 μmol/L胡桃醌组比较，Wnt激活剂LiCl与胡桃醌联合应用导致Snail蛋白表达升高，E-cadherin蛋白表达降低(P<0.01),见图4。

讨 论

肿瘤转移被认为是引起大多数肿瘤患者死亡的原因之一。EMT是肿瘤转移的早期阶段，使具有黏附形态及不具移动能力的上皮细胞极性消失,转变为不具有极性的间质细胞，失去细胞间紧密连接，从而使细胞获得迁移和侵袭能力[8]。组织和器官发生EMT过程的主要特征包括上皮细胞表型标志物(如E-cadherin)表达的减少及间质细胞表型标志物(如vimentin)的上调。E-cadherin具有维持正常上皮细胞的极性、保持细胞间紧密连接及防治细胞侵袭和转移扩散的作用。因此，E-cadherin的表达下降在EMT发生过程中起到重要的作用[9]。研究表明，EMT在前列腺癌的转移和治疗抵抗中也起到重要的作用，常规激素疗法后残留的前列腺癌细胞呈显著EMT表型[9]。因此，发现有效的治疗前列腺癌EMT的药物至关重要。

胡桃醌是从核桃楸中提纯的一种天然成分，已被证明在某些肿瘤细胞中具有抑制细胞增殖、侵袭和转移的功能[3-7]。在本研究中，我们发现胡桃醌能够抑制前列腺癌LNCaP细胞迁移和侵袭，并促进E-cadherin表达及抑制vimentin的表达的作用。结果表明，胡桃醌可能具有抑制前列腺癌细胞EMT、减少肿瘤细胞转移的作用。在EMT的发生过程中涉及到多种信号通路和诱导分子的调节，其中Wnt 信号通路是调节EMT的重要途径之一[10-11], β-catenin是Wnt途径的关键分子。Wnt通路活化后，能够使β-catenin在细胞核内聚集，与T细胞因子/淋巴增强因子形成复合物启动Snail等目的基因的转录。Snail是重要的促进EMT的分子，Snail可以直接结合在E-cadherin基因上游的启动子区域，通过降低E-cadhe-rin表达促进EMT的发生[11-13]。我们实验结果表明，胡桃醌能使β-catenin和Snail蛋白的表达下降，提示胡桃醌可能通过Wnt途径抑制前列腺癌LNCaP细胞EMT。为了进一步验证胡桃醌通过Wnt途径抑制前列腺癌细胞EMT的作用，我们使用了Wnt通路激活剂LiCl处理LNCaP细胞。结果发现，LiCl能够拮抗胡桃醌诱导的Snail蛋白的表达下调，导致E-cadherin表达下调。

Figure 3.The protein expression of β-catenin and Snail in the LNCaP cells treated with juglone at different doses. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

图3胡桃醌对LNCaP细胞β-catenin和Snail蛋白表达的影响

Figure 4.The protein expression of Snail and E-cadherin in the LNCaP cells treated with juglone and LiCl. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsjuglone group.

图4胡桃醌与LiCl联合作用对LNCaP细胞Snail和E-cadherin蛋白表达的影响

综上所述，本研究发现胡桃醌可能通过阻滞Wnt/β-catenin/Snail信号通路抑制前列腺癌细胞的EMT，从而降低前列腺癌细胞侵袭。本研究明确胡桃醌抑制前列腺癌细胞侵袭转移作用，并将其应用与前列腺癌的临床研究和治疗，提供一定的理论基础。