五参顺脉胶囊通过抑制内质网应激诱导的凋亡减轻大鼠冠脉侵入性损伤*

孙治霞， 索红亮， 王丽辉， 郭艳青， 李宗尚

[河南省中医院(河南中医药大学第二附属医院)心血管科， 河南 郑州 450002]

近年来研究表明，行冠状动脉造影和支架植入术的患者其术后的心肌酶谱或肌钙蛋白I均可见瞬时升高，提示在冠状动脉侵入性治疗时可对心肌造成一定损伤，这种现象被定义为“冠状动脉侵入性损伤”[1-2]，这种损伤主要是指由经皮冠状动脉介入术对血管内皮造成不可避免的损伤，进而引发炎性反应和血管重塑等，导致心肌缺血以及再灌注损伤等。

五参顺脉胶囊(Wushen-Shunmai capsule)是国家首届名中医毛德西教授汲取古人孙思邈《千金翼方》四参汤的经验，融合现代药理学研究结果，逐渐成为行之有效的经验方剂，疗效包括可显著改善心肌梗死以及心绞痛等疾病症状[3-4]。因此在本实验中，我们在传统研究基础上对五参顺脉胶囊的适应证进行进一步拓展，以大鼠体内心肌缺血再灌注为损伤模型，观察五参顺脉胶囊对大鼠冠状动脉侵入性损伤是否具有治疗作用。

多种外界刺激和病理状况(例如缺氧、氧化损伤、低血糖和高脂饮食等)可以引起内质网中未折叠蛋白的堆积导致细胞处于一种应激状态，即内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[5]。内质网应激信号通路被激活的初衷是为了减轻错误折叠蛋白的堆积，然而，内质网应激过度时将会引起细胞的死亡[6]。随着内质网应激与人类疾病之间关系被逐渐揭示[7-8]，内质网应激在心肌损伤中的作用也逐渐受到人们关注。五参顺脉胶囊是否可通过改善大鼠内质网应激状态治疗冠状动脉侵入性损伤目前尚未见报道。本研究以内质网应激为切入点，为五参顺脉胶囊的临床应用进一步提供科学理论依据。

材 料 和 方 法

1 实验动物与试剂

50只SPF级健康雄性SD大鼠(4～6月龄)，购自中科院上海斯莱克实验动物有限公司[生产许可证号为SCXK(沪)2017-0005]，饲养于河南省中医院SPF级动物房[使用许可证号为SYXK(豫)2016-0009]，普通大鼠饲料喂养，饮自来水，12 h光照轮换。

五参顺脉胶囊购自河南省中医院(含西洋参30 g，丹参30 g，北沙参30 g，三七参30 g，苦参30 g，赤芍50 g，川芎30 g，降香50 g，秦艽30 g，冰片15 g；研为细末，装胶囊，每粒含生药0.45 g)，丢弃胶囊壳，将药物取出后采用羧甲基纤维素钠制成含生药100 g/L的混悬剂；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride, TTC;分析纯)购自天津市科密欧化学试剂有限公司；TUNEL染色试剂盒购自于Roche；caspase-3/7和caspase-8分析试剂盒均购自江苏碧云天生物研究所；ECL化学发光法显色系统购自Bio-Rad；转录激活因子4(activating transcription factor 4, ATF4)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)和α-tubulin抗体购自Cell Signaling Technology。

2 方法

2.1大鼠心肌缺血再灌注模型制作 大鼠心肌缺血再灌注模型制作参考文献[9]。SD大鼠术前使用戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉，固定四肢与头部于手术台上，腹部皮肤消毒，待大鼠呼吸平稳后进行开胸术，打开心包，暴露心脏。找出冠状动脉左前降支，在分支处穿入结扎线并套入一塑料管进行冠状动脉结扎。冠脉缺血30 min后恢复心脏血液灌流，再灌注180 min。对照组其余处理与模型组相同，但不进行冠状动脉结扎。

2.2动物分组与给药处理 对照组10只大鼠；模型大鼠随机分为模型组、五参顺脉胶囊低剂量组、五参顺脉胶囊中剂量组和五参顺脉胶囊高剂量组，每组10只大鼠。五参顺脉大剂量组大鼠每次给药2 mL(0.900 g/kg)，中剂量组大鼠每次给药1 mL(0.450 g/kg)，小剂量组大鼠每次给药0.5 mL(0.225 g/kg)；对照组和模型组大鼠每次给予2 mL溶剂。给药2周后取心脏，每组取5只做冰冻切片用于TTC染色和TUNEL染色，另外5只保留组织用于caspase-3/7和caspase-8的活性测定和Western blot检测。

2.3心肌梗死体积测定 取梗死区心肌组织做0.5 μm厚度切片，将心肌切片置于预先温热至37 ℃的2% TTC溶液中，于37 ℃恒温敷箱中孵育15～20 min。待未梗死区(TTC染色呈红色)和梗死区(TTC染色呈白色)界限清晰后，去除TTC溶液，加入4%多聚甲醛溶液进行固定，拍照。之后利用Adobe Photoshop CS6软件计算出心肌缺血梗死区比例，梗死区比例(%)=梗死区/危险区×100%。

2.4TUNEL染色检测心肌组织中坏死细胞数目 TUNEL染色按照试剂盒提供说明书进行，每组样本随机选取相同部位进行染色。取各处理组心脏梗死区组织切片4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，每次3 min；3% H2O2封闭10 min，PBS洗3次，每次3 min；0.1% Triton X-100 透膜2 min；滴加100 μL TDT工作液37 ℃孵育1 h，PBS洗3次,每次3 min；滴加0.3% H2O2封闭内源性过氧化物酶活性，PBS洗3次,每次3 min；滴加100 μL Streptavidin-HRP工作液37 ℃孵育1 h，PBS洗3次,每次3 min；DAB显色5 min，中性树脂封片，显微镜观察拍照。TUNEL染色后任意选取梗死区域周围10个视野进行细胞计数，同时对TUNEL染色阳性细胞进行计数，计算凋亡指数(%)=TUNEL染色阳性细胞数目/总细胞数目×100%。

2.5Caspase-3/7和caspase-8活性的测定 按照caspase-3/7和caspase-8活性分析试剂盒说明书进行caspase-3/7和caspase-8活性测定。取各处理组心脏梗死区组织利用匀浆器进行匀浆,加入10倍体积组织裂解液在冰上将样品裂解20 min。裂解结束后，4 000 r/min 在4 ℃离心5 min，取各组样品上清，继续在13 200 r/min离心15 min。取上清，按照BCA试剂盒进行定量。蛋白浓度进行标准化处理后，分别加入底物Ac-DEVD-pNA和Ac-IETD-pNA室温孵育90 min，酶标仪检测波长在405 nm化学发光值。

2.6Western blot检测ATF4和CHOP蛋白的表达量 取各处理组心脏缺血区组织经匀浆、裂解、离心萃取蛋白，然后利用BCA试剂盒进行定量。取蛋白样品50 μg，加入5×SDS蛋白上样缓冲液，在沸水中煮5 min后以15% SDS-PAGE分离；之后用湿转法转移到PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入 I 抗ATF4(1∶ 1 000稀释)、CHOP(1∶ 2 000稀释)和ɑ-tubulin(1∶ 8 000稀释)，4 ℃孵育过夜；TBST 洗涤3次,每次5 min，加入相应 II 抗，室温孵育1 h，TBST洗涤3次,每次5 min。ECL化学发光法显色系统拍照，并以ɑ-tubulin为内参照，采用系统软件计算相对灰度值。

3 统计学分析

使用GraphPad Prism 6 软件进行统计分析。定量资料采用均数±标准差(mean±SD)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析并用Bonferroni校正的t检验对各组均数进行两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 五参顺脉胶囊对大鼠心肌缺血再灌注损伤所致梗死体积的影响

TTC染色结果显示，给予心肌缺血再灌注损伤处理后，心肌出现显著梗死区域,而在给予五参顺脉胶囊处理后，心肌梗死区域明显减小。经软件分析，与模型组相比，五参顺脉胶囊低、中、高剂量组心脏梗死体积与危险区体积之比均显著减少(P<0.05)，见图1。

Figure 1. Wushen-Shunmai capsule attenuated ischemia-reperfusion injury-induced myocardial infarction (TTC staining). Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

图1五参顺脉胶囊减少大鼠心肌缺血再灌注损伤所致心肌梗死面积

2 五参顺脉胶囊对缺血再灌注损伤所致心肌细胞凋亡率的影响

心肌缺血再灌注后，心脏梗死区组织切片中TUNEL阳性细胞明显增加，在给予五参顺脉胶囊处理后，可以观察到梗死区TUNEL阳性细胞明显减少。模型组中心脏梗死区TUNEL阳性细胞与总细胞之比为(13.48±2.52)%，五参顺脉胶囊低、中、高剂量组心脏梗死区TUNEL阳性细胞与总细胞之比较模型组均显著降低(P<0.05)，见图2。

Figure 2.Wushen-Shunmai capsule inhibited ischemia-reperfusion injury-induced cardiomyocyte apoptosis (TUNEL staining, ×200). Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

图2五参顺脉胶囊抑制大鼠心肌缺血再灌注损伤所致心肌细胞凋亡

3 五参顺脉胶囊对大鼠心肌缺血再灌注损伤时caspase-3/7和caspase-8活性的影响

在心肌缺血再灌注模型组，伴随着梗死面积的增加，凋亡信号通路效应分子caspase-3/7和caspase-8活性明显增加；在给予五参顺脉胶囊处理后，caspase-3/7和caspase-8活性相较于模型组显著降低(P<0.05)，见图3。

4 五参顺脉胶囊对内质网应激标志物ATF4和CHOP蛋白表达的影响

Western blot结果显示，心肌缺血再灌注后，内质网应激标志物ATF4和CHOP的蛋白表达量明显增加，给予五参顺脉胶囊处理后，ATF4和CHOP的表达被显著逆转(P<0.05)，见图4。该结果提示五参顺脉胶囊可通过抑制内质网应激所介导的细胞凋亡过程减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤，从而对大鼠冠脉侵入性损伤有一定的治疗作用。

讨 论

随着经皮冠状动脉介入手术的广泛普及，越来越多研究认识到手术本身可能对患者造成一些损伤[10-11]。由于手术造成的血管内皮损伤或者脱落，将不可避免引起炎症反应与血管重塑等，从而造成心肌缺血以及再灌注损伤等，这些侵入性损伤事件并逐渐成为各项研究热点。因此，研究冠状动脉侵入性损伤的发病机理，寻找有效减轻损伤策略，对临床治疗冠状动脉侵入性损伤具有重要价值。

Figure 3.Wushen-Shunmai capsule inhibited ischemia-reperfusion injury-induced activities of caspase-3/7 (A) and caspase-8 (B). Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

图3五参顺脉胶囊对大鼠心肌缺血再灌注损伤心肌caspase-3/7和caspase-8活性的影响

Figure 4. Wushen-Shunmai capsule reversed ischemia-reperfusion injury-induced expression of ERS-regulating proteins. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

图4五参顺脉胶囊逆转心肌缺血再灌注损伤所致内质网应激调控蛋白ATF4和CHOP的表达

除经典的死亡受体途径和线粒体凋亡途径，内质网应激介导的细胞凋亡逐步引起关注。内质网是调节Ca2+和加工蛋白质的重要场所，在外界刺激或者病理情况下将会导致内质网中未折叠蛋白的堆积，从而触发内质网应激状态，在未折叠蛋白不能得到有效清除时，将会导致细胞趋向死亡[12]。近来研究表明，内质网应激反应是心肌缺血再灌注病理过程发生与发展中的重要损伤因素[13-14]。

在本研究中，我们以大鼠心肌缺血再灌注模型为代表，观察到五参顺脉胶囊可显著减轻由心肌缺血再灌注所造成的损伤，提示五参顺脉胶囊对大鼠冠状动脉侵入性损伤可具有保护作用。在这里我们进一步进行机理探讨发现，五参顺脉胶囊可抑制心肌缺血再灌注损伤时内质网应激标志物ATF4和CHOP的表达，同时对凋亡执行分子caspase-3/7和caspase-8的活性也有显著抑制作用。这些结果表明五参顺脉胶囊可通过抑制内质网应激介导的细胞凋亡对大鼠心肌缺血再灌注发挥保护作用，这为五参顺脉胶囊应用于治疗冠状动脉侵入性损伤提供了可靠的临床前研究资料。

综上所述，五参顺脉胶囊可用于治疗冠状动脉侵入性损伤，其分子机制与五参顺脉胶囊对内质网应激介导的细胞凋亡有关。通过本研究我们丰富与完善了冠状动脉侵入性损伤的发病机制，并依此提出有效减轻冠状动脉侵入性损伤的措施，拓展了五参顺脉胶囊的临床应用。