siRNA敲减缺氧诱导因子1α表达对口腔鳞癌细胞活力及癌胚抗原相关细胞黏附分子1表达的影响*

雷雨广， 张伟丽， 陈 超， 杜尊国

(1信阳市第二人民医院病理科, 2信阳职业技术学院护理学院， 河南 信阳 464000； 3复旦大学附属华山医院病理科， 上海 200031)

口腔癌是常见的严重危害人类健康的恶性肿瘤之一。近年来，口腔癌的发病率和死亡率逐年增加，至今未找到高效的治疗方法[1-3]。鳞状细胞癌占口腔颌面部恶性肿瘤的80%以上，是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤[4],因此本文选用口腔鳞癌细胞进行相关研究。RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术可从源头上“沉默”机体中的特定致癌基因，从而达到治疗肿瘤的作用，为解决口腔癌的临床治疗问题带来了希望。近年来的研究发现，缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)在多种恶性实体瘤组织中的表达量显著增加，并与肿瘤的发生、发展、转移和预后等密切相关[5-6]。研究表明，HIF-1α还与肿瘤的恶性程度呈现正相关性，因此普遍认为HIF-1α是一种致癌基因[7]。本实验检测了HIF-1α在口腔磷癌细胞以及正常口腔上皮细胞中的表达量，并通过RNAi技术设计靶向沉默HIF-1α的siRNA表达载体，转染口腔癌细胞，观察HIF-1α在人口腔鳞癌中表达的变化，并探讨其水平的变化对口腔癌细胞活力和凋亡的影响以及作用机制。

材 料 和 方 法

1 实验材料

正常口腔黏膜上皮细胞系NOK购自中国典型培养物保藏中心；口腔鳞癌细胞系Tca8113和CAL27购自中科院上海细胞库。DMEM培养基和TRIzol试剂购自Gibco；胎牛血清购自HyClone；逆转录试剂盒购自大连TaKaRa；苯甲基磺酰氟(phenyl-methanesulfonyl fluoride，PMSF)和细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天公司；噻唑蓝(methylthiazolyl diphenyltetrazolium bromide，MTT)和二甲基亚砜(di-methyl sulfoxide, DMSO)购自Sigma；Lipofectamine 2000转染试剂盒购自Invitrogen；鼠抗人HIF-1α单克隆抗体、β-肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体、鼠抗人血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)单克隆抗体、鼠抗人Bcl-2单克隆抗体和鼠抗人Bax单克隆抗体购自Santa Cruz； 鼠抗人癌胚抗原相关细胞黏附分子1(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecular 1，CEACAM1)单克隆抗体购自Abcam；兔抗人P21单克隆抗体购自Cell Signaling Technology。细胞培养箱和酶标仪购自Thermo；流式细胞仪购自Beckman Coulter；荧光定量PCR仪购自Roche。

2 实验方法

2.1细胞的培养 NOK细胞、Tca8113细胞和CAL27细胞均置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，并加入1%的双抗，放入37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中，待细胞浓度达到90%进行传代。弃去培养基，加入1 mL胰酶消化约1～2 min，加入2 mL完全培养基，冲洗培养瓶壁上的细胞，离心，弃去上清液，分装至2个新的培养瓶中，继续培养。

2.2RT-PCR检测口腔鳞癌细胞以及正常上皮细胞中HIF-1α和CEACAM1的mRNA表达量 收集细胞，加入1 mL TRIzol吹打均匀，冰上裂解5 min，提取细胞总RNA。加入1.0 μL逆转录酶，94 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 30 s，30个循环，合成cDNA。根据GenBank中基因的序列，由上海生工合成基因引物，HIF-1α上游引物序列为5’-TGCTTGGTGCTGATTTGTGA-3’，下游引物序列为5’-GGTCAGATGATCAGAGTCCA-3’；CEACAM1的上游引物序列为5’-AAGCGACCAGCGTGATCT-3’，下游引物序列为5’-AAAGTTCAGGGTAGAATAAGTAACTTCA-3’；GAPDH的上游引物序列为5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’，下游引物序列为5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’。以cDNA为模板，GAPDH为内参照，反应体系为20 μL，反应条件: 95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s, 55 ℃ 10 s, 72 ℃ 15 s， 40个循环；65 ℃ 5 s, 40 ℃ 10 s。实验重复3次。

2.3Western blot检测口腔鳞癌细胞以及正常上皮细胞中HIF-1α和CEACAM1的蛋白表达量 收集5×106个细胞，每孔加入100 μL PMSF细胞裂解液，提取细胞中总蛋白，与等体积2×上样缓冲液混合均匀，沸水加热5 min，离心；将玻璃板、梳子清洗干净，配置10%的分离胶，小心注入玻璃板缝隙中，预留3cm高度的空间，加入去离子水，静置60 min；制备5%的堆积胶，弃去双蒸水，晾干，将堆积胶注入分离胶上部，插入梳子，待堆积胶凝固，拔去梳子，置于电泳槽中，加入1×电泳液。吸取20 μL蛋白样品加入上样孔，恒压80 V电泳至溴酚蓝到达堆积胶边缘，调整电压120 V，直至溴酚蓝到达凝胶底部。将PVDF膜一端接正极，凝胶一端接负极，恒定电流280 mA转膜35 min；加入封闭液，室温封闭2 h；弃去封闭液，加入 I 抗，4 ℃孵育过夜，TBST漂洗3次，每次5 min，加入II抗，37 ℃孵育1.5 h，TBST漂洗3次，每次5 min，暗室中显色，曝光，拍照，Quantity One分析蛋白质灰度值。同法检测HIF-1α下游P53、P21、VEGF、Bcl-2和Bax蛋白水平的变化。

2.4细胞的转染 CAL27细胞分为空白对照(blank control)组、无义对照(non-sense control)组和siRNA-HIF-1α组。转染前24 h，取对数期细胞计数，以每孔2×105个接种于6孔板中，37 ℃细胞培养箱中继续培养，待细胞融合率达到40%～50%左右，开始转染。3条有效siRNA-HIF1α片段由上海吉玛制药有限公司合成，实验前筛选出干扰效果较强的片段，正义链为5’-GATCCGAAAGATAGAGCAAGACAATTCA-AGAGATTGTCTTGCTCTATCTTTCTTTTTTGGAAA-3’，反义链为5’-AGCTTTTCCAAAAAAGAAAGATAGAGCAAGACAATCTCTTGAATTGTCTTGCTGTATCTTTGG-3’；无义对照正义链为5’-GATCCGTATAAGTCAA-CTGTTGACTTCAAGAGAGTCAACAGTTGACTTATAC-TTTTTTGGAAA-3’，反义链为5’-AGCTTTTCCAAAA-AAGTATAAGTCAACTGTTGACTCTTGAAGTCAACAG-TTGACTTATACG-3’。根据脂质体Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书将无义对照和siRNA-HIF1α序列分别转染入CAL27细胞后，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养48 h。转染后，根据2.3所示的方法，用Western blot检测转染后细胞中HIF-1α蛋白的表达量。

2.5MTT法检测细胞的活力 将各组CAL27细胞以每孔1×105接种于96孔板中，每组3个复孔，37 ℃培养48 h，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，37 ℃恒温箱培养4 h，弃去上清，加入100 μL DMSO，37 ℃摇床中孵育30 min，酶标仪检测细胞在570 nm的吸光度(A)值，实验重复3次，取平均值。

2.6流式细胞术检测细胞的凋亡能力 收集各组细胞，胰酶消化，以结合缓冲液将细胞浓度调整为1×109/L，取100 μL细胞悬浮液加入24孔板中，培养24 h后，每孔加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL 碘化丙啶(propidium iodide，PI)，避光反应15 min，流式细胞术分析细胞的凋亡率。

3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计处理，结果以平均数±标准差(mean±SD)表示，多组数据间的比较采用单因素方差分析，组间两两比较使用Bonferroni校正的t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 口腔鳞癌和正常口腔上皮细胞中HIF-1α和CEACAM1 mRNA和蛋白表达量的变化

与NOK细胞相比，Tca8113和CAL27细胞HIF-1α的mRNA和蛋白表达量显著上调(P<0.05)，CEACAM1的mRNA和蛋白水平显著增加(P<0.05)；与Tca8113细胞相比，CAL27细胞中HIF-1α和CEACAM1的mRNA和蛋白水平显著增加(P<0.05)，且HIF-1α 与CEACAM1的表达量呈正相关(r2=0.685，P=0.012)，见图1、表1。这表明HIF-1α和CEACAM1在口腔鳞癌细胞中的表达量显著高于正常细胞，提示HIF-1α 可能参与口腔鳞癌的发生、发展过程。

Figure 1.The images of Western blot for determining the protein expression of HIF-1α and CEACAM1 in the oral squamous cell carcinoma and normal epithelial cells.

图1Westernblot检测口腔鳞癌和正常口腔上皮细胞中HIF-1α和CEACAM1蛋白的表达量

表1口腔鳞癌和正常口腔上皮细胞中HIF-1α和CEACAM1的mRNA和蛋白表达量

Table 1.The expression of HIF-1α and CEACAM1 at mRNA and protein levels in oral squamous cell carcinoma and normal epithelial cells (Mean±SD.n=3)

Cell linemRNA expressionProtein expressionHIF-1α CEACAM1 HIF-1αCEACAM1NOK0.065±0.0080.009±0.0010.124±0.0130.215±0.020Tca81130.123±0.014*0.073±0.008*0.456±0.069*0.436±0.048*CAL270.256±0.027*#0.152±0.017*#0.834±0.085*#0.649±0.067*#

*P<0.05vsNOK;#P<0.05vsTca8113.

2 转染后CAL27细胞中HIF-1α蛋白水平的变化

以CAL27细胞作为后续实验的研究对象，将siRNA-HIF-1α转染入CAL27细胞，Western blot 检测细胞中HIF-1α蛋白的表达量，结果显示,与空白对照组和无义对照组比较，siRNA-HIF-1α组细胞中HIF-1α蛋白的表达量显著降低(P<0.05)；无义对照组与空白对照组相比细胞中HIF-1α蛋白表达量的差异无统计学显著性，见图2。

Figure 2.The protein level of HIF-1α in the cells after transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank control group.

图2转染后细胞中HIF-1α蛋白水平的变化

3 沉默HIF-1α表达对CAL27细胞活力的影响

与空白对照组相比，无义对照组细胞活力的差异无统计学显著性，siRNA-HIF-1α组细胞活力显著降低(P<0.05),见图3。

Figure 3.The effect ofHIF-1αknockdown on the viability of CAL27 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank control group.

图3沉默HIF-1α表达对CAL27细胞活力的影响

4 沉默HIF-1α表达对CAL27细胞凋亡的影响

与空白对照组相比，无义对照组的细胞凋亡率差异无统计学显著性，siRNA-HIF-1α组的细胞凋亡率显著增加(P<0.05),见图4。

Figure 4.The effect ofHIF-1αknockdown on the apoptosis of CAL27 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank control group.

图4沉默HIF-1α表达对CAL27细胞凋亡的影响

5 沉默HIF-1α表达对HIF-1α下游靶蛋白水平的影响

无义对照组细胞中HIF-1α下游靶蛋白的表达量与空白对照组间的差异无统计学显著性；siRNA-HIF-1α组细胞中P21和Bax的蛋白水平较空白对照组显著增加(P<0.05)，Bcl-2和VEGF蛋白水平显著降低(P<0.05)，见图5、表2。

讨 论

口腔癌的发病率位于恶性肿瘤的前列，近年来的新发病例逐渐增加，因此预防和治疗口腔癌是一项艰巨的任务。口腔鳞癌是口腔癌常见的病理类型，极易复发，严重影响人们的健康。HIF-1α是一种在多种实体肿瘤中高表达的基因，其表达量不仅与肿瘤的发生和发展有关，还与肿瘤的转移及患者的生存期密切相关，是预后不良和复发的常用指标[8-9]。HIF-1α已成为近年来研究的热点致癌基因。本实验通过RT-PCR和Western blot检测口腔鳞癌Tca8113和CAL27细胞以及正常上皮细胞NOK中HIF-1α的表达量，结果显示HIF-1α在口腔鳞癌Tca8113和CAL27细胞中的表达量显著高于正常细胞NOK，表明HIF-1α在口腔鳞癌中的表达量显著上调。研究表明，在口腔鳞癌组织中，HIF-1α的表达量上调[10]，表明HIF-1α可能参与口腔癌的发生、发展，其中HIF-1α在CAL27细胞中的表达量显著高于Tca8113细胞，因此本文后续实验以CAL27细胞为研究对象。

Figure 5.The images of Western blot for determining the protein levels of downstream molecules of HIF-1α after theHIF-1αexpression in the CAL27 cells was silenced.

图5Westernblot检测沉默HIF-1α表达对HIF-1α下游靶蛋白水平的影响

肿瘤的发生、发展与肿瘤细胞的恶性增殖和凋亡减少有关，其中细胞的过度增殖是恶性肿瘤的主要特征之一[11]。目前，在多种肿瘤细胞中特异性降低HIF-1α基因的表达，可显著抑制细胞的增殖、凋亡等生物学特性[12-14]。在本研究中，采用脂质体将siRNA-HIF-1α表达载体转染入CAL27细胞，结果发现siRNA-HIF-1α组细胞中HIF-1α的表达量显著低于空白对照组，提示转染成功；MTT和流式细胞术检测细胞的活性和凋亡率，发现沉默HIF-1α的表达量显著抑制CAL27细胞的活性，其凋亡率显著增加。在膀胱癌、非小细胞肺癌中，下调HIF-1α的表达可抑制细胞的生长并诱导其凋亡，与本实验结果一致，提示HIF-1α可能是口腔癌分子靶向治疗的潜在位点。

表2沉默HIF-1α表达对HIF-1α下游靶蛋白水平的影响

Table 2.The effect ofHIF-1αknockdown on the protein levels of downstream molecules of HIF-1α (Mean±SD.n=3)

GroupP21Bcl-2BaxVEGFBlank control0.668±0.0781.265±0.1370.856±0.0841.355±0.0174Non-sense control0.652±0.0771.318±0.1420.863±0.0891.368±0.141siRNA-HIF-1α0.978±0.120*0.952±0.096*1.145±0.136*0.723±0.071*

*P<0.05vsblank control group.

众所周知，Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡过程中发挥重要作用。Bcl-2家族蛋白根据其功能的不同分为抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白，Bcl-2为主要的抑凋亡蛋白，Bax为主要的促凋亡蛋白。Bcl-2和Bax的表达量发生变化，诱导线粒体细胞色素C和凋亡诱导相关因子的分泌增加，激活细胞中caspase蛋白酶的活性，从而诱导细胞凋亡[15-16]。P21是一种重要的细胞周期依赖性激酶的抑制因子，主要通过抑制细胞周期G1/S的转换，使细胞周期阻滞在G1期，从而抑制细胞的增殖[17-18]。HIF-1α在口腔癌中的作用机制尚不清楚。本研究中，siRNA-HIF-1α组细胞中Bcl-2的表达量显著降低，Bax和P21蛋白水平显著增加，提示HIF-1α可能通过调控Bcl-2家族蛋白的表达以及上调P21来发挥促CAL27细胞凋亡的作用。

肿瘤的预后主要表现在血管和淋巴的转移，因此抑制肿瘤新血管的生成和淋巴转移是提高肿瘤患者生存率、改善预后不良的重要策略[19-20]。肿瘤的血管生成与机体中的生长因子如VEGF等有关。研究表明，VEGF在多种实体肿瘤中表达量上调，与细胞的生物学行为密切相关，在肿瘤的新血管生成过程中发挥关键作用[21-23]。HIF-1α在调控VEGF表达的信号通路中发挥纽带作用，不仅能显著促进VEGF mRNA的表达量，还可显著促进VEGF mRNA的稳定性。CEACAM1是免疫球蛋白超家族的黏附分子，近年来发现其在肿瘤发生、发展过程中起重要作用[24]。CEACAM1主要参与调控与肿瘤预后相关的血管和淋巴管的生成。沉默CEACAM1基因的表达可抑制肿瘤毛细血管形成过程中VEGF诱导的血管形态发生效应[25]。本实验结果发现，在口腔癌细胞中CEACAM1的表达量显著高于正常上皮细胞，且与HIF-1α的表达量呈正相关性；沉默HIF-1α的表达显著抑制VEGF蛋白水平，表明HIF-1α的表达量与CEACAM1和VEGF水平密切相关，HIF-1α可能通过影响CEACAM1和VEGF的水平，阻碍肿瘤组织新血管的生成，从而抑制口腔癌的发生、发展。

综上所述，HIF-1α在口腔癌细胞中高表达。沉默HIF-1α的表达可以抑制口腔癌CAL27细胞的活力，诱导其凋亡。这可能通过其下游基因的表达以及肿瘤血管的生成来发挥调控作用。HIF-1α有望成为抗口腔癌的潜在靶向位点。