依达拉奉对急性脑缺血/再灌注大鼠AQP4和Aβ表达及MMP-2和MMP-9活性的影响*

刘 菡， 罗永杰

(1西南医科大学, 四川 泸州 646000； 2四川省医学科学院， 四川省人民医院神经内科， 四川 成都 610000)

急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke，AIS)是严重威胁我国国民健康的脑血管疾病之一，具有高死亡率和高致残率，且其发病呈逐年升高的趋势，成为临床上亟待攻克的焦点问题之一[1-3],而恢复AIS脑组织血液灌注极易引起缺血/再灌注(ische-mia/reperfusion，I/R)损伤[4]。依达拉奉(edaravone)是一种自由基清除剂，能控制脑水肿，并能减轻脑组织缺血再灌注损伤，常用于治疗脑梗死[5-6]。目前虽然关于依达拉奉治疗脑梗死的研究较多，但关于依达拉奉对急性缺血性脑卒中神经保护的机制依然不太明确，因此探讨依达拉奉对急性脑缺血/再灌注大鼠的实验效果及其作用机制，为其在AIS临床治疗方面提供理论根据。

材 料 和 方 法

1 实验动物

选取健康雄性SPF级SD大鼠136只，体质量180～200 g，平均(190.0±5.5) g，所有实验动物均喂养在光照12 h，湿度45%～60%，温度23 ℃～25 ℃，动物许可证号为SCXK(滇)2016-0014，饲养在自由进食进水的环境中。

2 药品和试剂

依达拉奉(20 mL∶30 mg，批号141109)购自昆明积大制药有限公司；TRIzol购自Invitrogen；引物合成由北京华大基因公司合成；qPCR试剂为大连宝生物SYBR® Premix Ex TaqTM试剂盒；抗水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)多克隆抗体和抗β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)多克隆抗体购自Proteintech。

3 方法

3.1大鼠局灶性脑缺血再灌注的造模方法 采用Longa改良线栓法构建大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，模拟急性缺血性脑卒中治疗[7]。用 10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射将大鼠麻醉后固定，取颈正中切口，分离并结扎右侧颈总动脉、颈外动脉，在右侧颈总动脉近交叉约5 mm处剪一个小口，用直径0.28 mm的鱼线插入颈内动脉，遇轻微阻力止，插入深度为20～22 mm，近端打活结，阻断右侧大脑中动脉血流，缝合皮肤。拴塞2 h后，拔出10 mm鱼线行再灌注；假手术(sham)组大鼠制备颈内动脉不插鱼线，其余操作同手术组；低剂量(low dose)组和高剂量(high dose)组大鼠于术前30 min腹腔注射依达拉奉6 mg/kg和依达拉奉10 mg/kg，造模后每24 h 腹腔注射给药1次，假手术组给予等量生理盐水，模型(model)组造模后给予等量生理盐水。采用Longa法对动物模型进行鉴定:纳入模型组、低剂量和高剂量组中大鼠清醒后(术后60 min)行走时向损伤对侧旋转和行走时向损伤对侧倾倒的大鼠，排除无自发活动或死亡大鼠,其中排除模型组1只当场死亡，1只无自发活动；假手术组、低剂量组和高剂量组各2只无自发活动，以上均是手术操作不当所致，共纳入SD大鼠128只进行研究。

3.2神经功能评分 采用Zea Longa 法对造模成功的大鼠6 h、1 d、2 d、3 d和7 d后的神经功能评价。无神经功能障碍，活动正常为0分;提尾部时不能完全伸展对侧前爪为1分；爬行时向损伤侧旋转为2分;爬行时向对侧倾倒为3分;无法活动或意识不清为4分。

3.3TTC法测定脑梗死体积 实验结束后，断头处死大鼠，分离脑组织，-20 ℃冰冻30 min，连续制作2 mm厚度冠状面5片切片。将脑组织切片立即悬置于2% TTC溶液中，37 ℃避光孵育30 min。随后置于4%多聚甲醛溶液浸泡固定2 h。梗死区呈白色，正常区呈玫瑰红色。应用病理图文报告分析系统测出脑梗塞体积百分比。

3.4脑组织含水量 大鼠断头取全脑，采用电子天平精密称量湿重；置全脑于组织真空烘箱，烘至恒重，电子天平精密称量干重。脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/ 湿重×100%。

3.5RT-qPCR检测AQP4和Aβ mRNA的相对表达量 取梗塞区脑组织约100 mg，参照TRIzol说明书采取一步法提取总RNA,检测样本中 RNA 纯度合格，然后反转录合成 cDNA。以cDNA为模板，用ABI 7500 Fast型real-time PCR仪进行PCR扩增。AQP4的正向引物序列为5’-GTGCTAGGAAACTGATATG-3’，反向引物序列为5’-TCTGGTGTAGTACATTCAA-3’；Aβ的正向引物序列为5’-CGGGATCCGATGCAGAATTCCGACATGACTCAG-3’，反向引物序列为5’-ACGCGTCGACCTACGCTATGCAACACCGCCCA-3’； GAPDH 的正向引物序列为5’-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3’，反向引物序列为5’-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3’。 反应条件：先用95 ℃孵育5 min;进行35个循环(94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s)。GAPDH为内参照，采用2-ΔΔCt法分析基因相对表达量。

3.6Western blot实验 冰上裂解梗死区组织匀浆后，12 000×g离心10 min，吸取上清液，萃取总蛋白，用 BCA 蛋白质定量试剂盒检测蛋白含量。蛋白煮沸变性后，上样60 μg，进行SDS-PAGE分离蛋白，经转膜、封闭。室温孵育 I 抗AQP4(1∶2 000)、Aβ(1∶1 000)和GAPDH(1∶4 000) 2 h后，用TBST洗3次,每次5 min；孵育对应的 II 抗1.5 h，用TBST洗3次,每次10 min。使用避光ECL显色检测蛋白条带。以Quantity One 软件进行图像灰度值分析，以GAPDH为内参照，校正各组Aβ和AQP4的灰度值。

3.7明胶酶谱检测基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)和MMP9的活性 冰上裂解梗死区组织匀浆后，12 000×g离心10 min，吸取上清液，萃取总蛋白，用 BCA 蛋白质定量试剂盒检测蛋白质含量。按照基质金属蛋白酶(MMP2/9)明胶酶谱法试剂盒说明操作。蛋白直接上样60 μg，进行SDS-PAGE分离，电泳结束后，将凝胶置于洗脱液洗3次,每次10 min，将凝胶置于孵育液中，37 ℃孵育6 h；孵育结束后，经0.05%考马斯亮蓝染色2 h，然后脱色2 h，用凝胶图像分析系统分析灰度值。

3.8HE染色病理学观察 分离梗死区脑组织，生理盐水冲洗，将完整脑组织放入4%多聚甲醛中固定。在真空组织脱水机内进行梯度乙醇浸润脱水，二甲苯透明处理，置于60 ℃液蜡I、II中分别浸润透蜡1.5 h，包埋后放至冷却，制成蜡块置于4 ℃保存片，切片(厚度为4 μm)，苏木素染色5 min，蒸馏水洗浸泡1 min，1%盐酸分化45 s，蒸馏水浸泡5 min，伊红复染5 min，脱水后，光镜下观察病变区脑组织病理变化。

4 统计学处理

统计软件采用SPSS 16.0，采用均数±标准差(mean±SD)进行统计描述，多组间比较采用单素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni校正的t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠神经功能评分的比较

术后模型组大鼠的神经功能评分逐渐升高(P<0.05),3 d后再降低(P<0.05)，且在2 d时神经功能评分最高(P<0.05)；与模型组相比，依达拉奉预处理组的神经功能评分明显降低(P<0.05)，且高剂量组降低最明显(P<0.05),见图1。

Figure 1.The neurological function scores of different groups. Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;&P<0.05vslow dose group.

图1各组大鼠神经功能评分

2 各组大鼠脑组织含水量的比较

术后模型组大鼠的脑组织含水量变化的差异均不具有统计学显著性。与模型组相比，依达拉奉预处理能明显预防脑水肿(P<0.05)；相对于低剂量组，高剂量组在术后1～3 d的脑组织含水量明显降低(P<0.05)，而术后7 d的差异差异无统计学显著性(P>0.05),见图2。

Figure 2.The brain water content in different groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;&P<0.05vslow dose group.

图2各组大鼠脑组织含水量

3 各组大鼠脑梗死体积的比较

术后模型组大鼠的脑梗死体积逐渐升高(P<0.05),后稍微降低(P<0.05)，且在术后2 d梗死体积最高(P<0.05)；与模型组相比，依达拉奉预处理组的脑梗死体积明显降低(P<0.05)，且高剂量组降低最明显(P<0.05)，见图3。

4 各组大鼠脑组织病理形态的比较

假手术组未见明显变化；术后模型组大鼠的脑梗死区出现细胞核固缩，脑组织水肿十分明显，且在术后2 d出现大量白细胞浸润，术后7 d症状有所减轻；与模型组相比，依达拉奉预处理组的脑梗死白细胞浸润明显减轻，且高剂量组在术后7 d，白细胞浸润基本消失，见图4。

5 各组大鼠脑梗死区组织AQP4 和Aβ mRNA水平的比较

术后1 d和2 d，与假手术组相比，模型组AQP4和Aβ的mRNA水平明显升高(P<0.05)；与模型组相比，依达拉奉预处理组AQP4和Aβ的mRNA水平明显降低(P<0.05)，且高剂量组降低最明显(P<0.05)，见表1。

Figure 3.Typical macrographs of TTC staining in different groups. Mean±SD.n=5.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;&P<0.05vslow dose group.

图3各组大鼠脑组织的TTC染色观察

Figure 4.Typical histological images with HE staining of different groups (×200).

图4各组大鼠脑组织HE染色结果

表1各组大鼠脑梗死区AQP4和AβmRNA水平的比较

Table 1.The mRNA levels of AQP4 and Aβ in different groups (Mean±SD.n=5)

TimeGroupAQP4Aβ 1 dSham0.053±0.0110.321±0.046Model0.139±0.028*1.385±0.115*Low dose0.104±0.020*#0.984±0.097*#High dose0.081±0.017*#&0.752±0.095*#&2 dSham0.052±0.0130.328±0.056Model0.154±0.029*1.785±0.216*Low dose0.091±0.020*#0.873±0.089*#High dose0.072±0.013*#&0.564±0.086*#&

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;&P<0.05vslow dose group.

6 各组大鼠脑组织中AQP4和Aβ蛋白水平的比较

术后1 d和2 d，与假手术组相比，模型组的AQP4蛋白和Aβ 蛋白水平明显升高(P<0.05)；与模型组相比，依达拉奉预处理组的AQP4蛋白和Aβ 蛋白水平明显降低(P<0.05)，且高剂量组降低最明显(P<0.05)，见图5。

7 各组大鼠脑组织中MMP2和MMP9活性的比较

术后1 d和2 d，与假手术组相比，模型组的MMP2和MMP9活性明显升高(P<0.05)；与模型组相比，依达拉奉预处理组的MMP2和MMP9活性明显降低(P<0.05)，且高剂量组降低最明显(P<0.05)，见表2。

Figure 5.The protein levels of AQP4 and Aβ in different group. A: 1 d after operation; B: 2 d after operation. Mean±SD.n=5.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;&P<0.05vslow dose group.

图5各组大鼠的脑梗死区中AQP4蛋白和Aβ蛋白水平的比较

表2各组大鼠脑梗死区MMP2和MMP9活性的比较

Table 2.The activity of MMP2 and MMP9 in different groups (Mean±SD.n=5)

TimeGroupMMP2MMP9 1 dSham1.603±0.0210.819±0.064Model2.792±0.068*2.116±0.132*Low dose2.533±0.084*#1.842±0.090*#High dose2.194±0.076*#&1.494±0.078*#& 2 dSham1.608±0.0250.817±0.052Model2.524±0.087*2.032±0.118*Low dose2.108±0.095*#1.436±0.076*#High dose1.842±0.091*#&1.152±0.061*#&

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;&P<0.05vslow dose group.

讨 论

急性缺血性脑卒是人类死因排名第2位的脑血管疾病，具有高死亡率和高致残率，且其发病呈逐年升高的态势[1-2]。而对于AIS的治疗是及早恢复脑组织血液灌注，而血液恢复灌注极易出现I/R损伤[4]。脑I/R损伤不仅能产生过度自由基，还能导致脑水肿发生[8-9],而脑水肿不仅是脑I/R损伤的病理生理机制之一，而且与患者病情进程相关，脑水肿机械占位损伤和继发性损伤是引起患者死亡的主要原因[9-10]。AQP4作为一种双向水转运通道蛋白，与脑水肿的发生发展关系密切，是脑水肿形成以及消退的重要分子[11-12]，早期AIS出现细胞毒性脑水肿，且伴随轻度血管源性脑水肿，后者可导致脑中风患者病情加重以及恶化，甚至引起患者死亡，因此是否能有效控制脑水肿是治疗的关键[13]。依达拉奉具有减轻脑水肿、减轻脑组织缺血再灌注损伤，保护脑组织及改善预后的作用[14]。研究发现，依达拉奉预处理能有效降低急性脑缺血/再灌注大鼠神经功能评分，神经功能障碍；且进一步研究发现，依达拉奉预处理能有效降低脑组织含水量，减轻脑水肿；对脑梗死区脑组织AQP-1的mRNA和蛋白的表达水平检测发现，依达拉奉预处理能有效降低脑组织AQP-1 的mRNA和蛋白的表达水平。

近来研究发现AIS的发生与Aβ沉积相关[15]。在AIS早期Aβ沉积与炎症因子存在相互促进关系，脑I/R损伤产生过度自由基，介导小胶质细胞炎症反应促使炎症因子快速释放，导致Aβ沉积，后者又促使炎症因子级联放大，加重神经组织损伤[16]，且Aβ沉积能导致血脑屏障通透性增加，又进一步导致脑水肿的发生[17]。本研究发现，急性脑缺血/再灌注大鼠术后1 d和2 d脑组织Aβ mRNA和蛋白水平明显升高，依达拉奉预处理能有效降低急性脑缺血/再灌注大鼠脑组织Aβ蛋白沉积；进一步通过HE染色观察脑组织病理结构变化，结果显示依达拉奉预处理能有效降低白细胞侵润，减轻组织学损伤。

有研究证明，MMP2和MMP9在星形胶质细胞和内皮细胞中至关重要，二者水平含量的升高可导致神经细胞损伤，进而导致脑水肿[18]。因此本文对比考察各组二者的水平，结果显示，依达拉奉预处理能有效降低急性脑缺血/再灌注大鼠脑组织MMP2和MMP9活性，提示依达拉奉可抑制MMP2和MMP9的活性，改善急性脑缺血/再灌注预后。

综上所述，本文通过研究依达拉奉能显著降低急性脑缺血/再灌注大鼠AQP4和Aβ的mRNA和蛋白水平，抑制MMP-2和MMP-9活性，进而抑制神经功能障碍、脑组织学损伤和脑水肿，但具体机制仍需作进一步研究。