广西人群S100B基因多态性与系统性红斑狼疮的相关性研究*

陆玉兰， 刘纯宏， 王 荣， 黄华佗， 曾永龙， 韦叶生△， 蓝 艳

(右江民族医学院附属医院 1检验科， 2皮肤科， 广西 百色 533000)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种的常见自身免疫性疾病，临床上常累及机体多器官脏器，病程迁延反复。近年来，我国SLE的患病率呈现逐年上升的趋势，严重影响患者的生活质量，给社会和家庭带来沉重的经济负担[1]。然而，SLE的病因及发病机制迄今尚未完全阐明。流行病学研究表明，SLE是一种由遗传因素和环境因素共同作用而导致的复杂疾病，其中遗传因素在SLE的发病过程中起着重要的作用[2]。S100钙结合蛋白B(S100 calcium-binding protein B, S100B)属于S100超家族的成员之一，广泛表达于机体多种组织和细胞表面。最近研究发现异常表达的S100B蛋白与多种免疫性疾病的发生、发展密切相关[3-6]。此外，已有研究表明S100B基因位点突变可以促进血清S100B蛋白水平的表达[7-8]。然而，S100B基因突变是否与SLE的发生具有相关性，目前尚未有报道。因此，本研究通过病例-对照研究，探讨S100B基因多态性与SLE及其临床表现的关系，为进一步阐明遗传易感基因在SLE发生发展中的作用机制提供有利依据。

材 料 和 方 法

1 对象

1.1SLE组 选取2013年1月～2016年9月在右江民族医学院附属医院被皮肤科确诊的SLE患者313例。SLE的诊断符合1997年美国风湿病学会修订的SLE分类诊断标准。

1.2对照组 选取2013年1月～2016年9月到右江民族医学院附属医院进行体检的体检者396例，均无感染性疾病史、神经系统病变史、自身免疫性疾病史和严重心肝肾等重要脏器功能不全等。研究对象均来自广西地区人群。该研究由右江民族医学院附属医院医学伦理委员会批准，研究对象均已签署知情同意书。

1.3临床基本资料 利用医院的病例管理系统收集已确认为SLE患者的临床基本资料，主要包括年龄、性别、颧部红斑、光过敏、胸膜炎、关节炎、肾炎和神经系统病变等。

2 方法

2.1基因组DNA的提取 采集受试者静脉血3.0 mL，用乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝。采用离心柱法(北京天根公司)提取基因组DNA，-70 ℃保存备用。

2.2引物的设计与合成 根据NCBI数据库中的S100B基因序列，选择包含rs9984765、rs2839356 和rs2186358位点的碱基，用Primer 5.0软件设计PCR引物，引物由上海天昊生物科技有限公司合成。用于特异性扩增S100B基因3个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点碱基的DNA片段引物序列见表1。

2.3PCR扩增 采用20 μL反应体系，其中包括2 μL缓冲液(1×GC-I buffer; TaKaRa)、2 μL Mg2+(3 mmol/L)、2 μL dNTP (0.3 mmol/L)、1 U HotStar Taq 聚合酶(Qiagen)、1 μL 多重PCR引物(20 μmol/L)和1 μL DNA模板 (0.2 μg)，余下体积用经过严格高压灭菌的双蒸水补足。PCR参数为95 ℃预变性2 min；扩增阶段为94 ℃预变性20 s、65 ℃退火40 s、72 ℃延伸1.5 min，循环11次；94 ℃预变性20 s、59 ℃退火30 s、72 ℃延伸1.5 min，循环24次；最后阶段72 ℃延长2 min。PCR产物经过虾碱性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase，SAP; Promega)和外切酶I(Epicentre)纯化后用ABI的SNaPshot Multiplex kit进行延伸反应。延伸产物用SAP纯化后在ABI 3730xl上样。SNP分型用GeneMapper 4.1软件来分析。

表1S100B基因3个SNP位点的PCR引物序列

Table 1.The primer sequences used for detecting the 3 SNP sites ofS100Bgene

SNP sitePrimer sequence (5’-3’)rs9984765F: CTCCACAGAGCCTCCTGCAAAGR: CCTGGCACATGGATGAATGACCEF: TTTTTTTTTTTTACCATGACTGGCTTAACTGAGGrs2839356F: TCACCTTCAGGGCAGCTGAGAAR: TGGAAGGGAGGGAGACAAGCACEF: TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAGATAAAGCCAGTGTACAGATGGATrs2186358F: GACATCCTAGGGGCTCGCAAAGR: CCCCTTGTCTGGGTTGAGGTCTEF: TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGTTGCCTTCTCATCTATACCTCATC

F: forward； R: reverse； EF: extension primer.

3 统计学处理

数据分析采用SPSS 17.0软件计算，采用Hardy-Weinberg平衡定律评估该研究样本的群体代表性。计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，采用t检验；分类变量采用2检验。采用logistic 回归方法计算优势比(odds ratio, OR)及其95%可信区间(confidence interval, CI),评估各位点基因多态性与SLE易感性的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 S100B基因SNP分型结果

SNP分型结果显示，rs9984765存在TT、CT和CC基因型，rs2839356存在TT、CT和CC基因型，rs2186358存在AA、AC和CC基因型，DNA测序法验证了上述的分型结果，见图1。

2 研究对象的基本临床资料

本研究共纳入符合条件的SLE患者组313例，年龄为(38.05±12.93)岁，其中男性63例(20.13%)，女性250例(79.87%)；对照组396例，年龄为(39.48±12.10)岁，其中男性98例(24.75%)，女性298例(75.25%)。年龄和性别在病例组和对照组间差异无统计学显著性，见表2。

Figure 1.The sequencing map ofS100Bgene rs9984765, rs2839356 and rs2186358. A: ①, ② and ③ were the sequencing map of TT, CT and CC genotypes for rs9984765; B: ①, ② and ③ were the sequencing map of TT, CT and CC genotypes for rs2839356; C: ①, ② and ③ were the sequencing map of AA, AC and CC genotypes for rs2186358. The arrows were loci of genetic mutations.

图1S100B基因rs9984765、rs2839356和rs2186358位点的测序图

表2 SLE患者组和对照组的临床基本资料

3 S100B基因多态性与系统性红斑狼疮易感性的相关性分析

S100B基因rs9984765、rs2839356和rs2186358位点的基因型在对照组中分布均符合Hardy-Weinberg平衡。在SLE患者组和对照组中，比较S100B基因rs9984765、rs2839356和rs2186358位点基因型和等位基因频率的分布情况。经logistic回归方法分析，结果发现rs9984765和rs2186358位点的基因型和等位基因频率在SLE患者组和对照组间分布差异均无统计学显著性，然而rs2839356位点等位基因C与G比较，差异有统计学意义(P=0.040)，见表3。

表3 S100B基因多态性与系统性红斑狼疮的遗传易感性

HWE: Hardy-Weinberg equilibrium; Ref: reference.

4 S100B基因多态性与SLE患者的临床表现

SLE 患者临床表现复杂，因此我们进一步分析了S100B基因3个位点的等位基因与SLE患者常见临床表现的关系。结果显示，rs2839356位点C等位基因频率在伴有神经系统病变的SLE患者中(47.2%)高于不伴有神经系统病变的SLE患者(36.6%)，而rs2839356位点C等位基因在是否伴有颧部红斑、光过敏、胸膜炎、关节炎和肾炎的SLE患者间分布差异均无统计学显著性，见表4。

表4 rs2839356等位基因与SLE患者临床表现的关系

+: positive; -: negative.

讨 论

S100B属于S100蛋白超家族中活性最强的成员，相对分子质量为21 kD，是一种主要由星形胶质细胞分泌的酸性钙结合蛋白。最近有研究发现巨噬细胞、树突状细胞和淋巴细胞亚群等也可以分泌S100B[9]。S100B蛋白具有多样的生物学功能，如调控细胞的增殖与分化、参与细胞间信号转导及调节细胞内Ca2+平衡等[10]；此外，S100B蛋白可以通过与晚期糖基化产物受体结合后激活一系列细胞信号通路，刺激白细胞介素1β(interleukin-1β， IL-1β)、IL-6、干扰素γ和肿瘤坏死因子α等多种炎症因子的释放[11-12]，而这些炎症因子在SLE的发病过程中发挥重要的作用。同时，有研究表明S100B与RAGE相互作用可以激活核因子κB及其下游P38丝裂原激活蛋白激酶信号通路，从而参与调节T细胞的免疫过程[13]。结合S100B基因位点突变可以促进血清S100B蛋白水平的表达以及S100B蛋白在多种免疫炎症性疾病的发生、发展过程中扮演重要的角色，我们推测S100B基因多态性可能与SLE的发病机制有关联。

S100B基因定位于人类21号染色体q22.2～q22.3区域，主要由3个外显子和2个内含子组成，其mRNA长度为1 095 bp，编码91个氨基酸。近年来，越来越多的研究报道S100B基因突变与多种疾病的发生、发展密切相关。Dagdan等[14]研究发现rs3788266位点可能是双向情感障碍患者的易感基因，而且该位点的G等位基因与血清S100B及其mRNA的高度表达具有相关性。Matsson等[15]研究表明rs9722的T等位基因可能是阅读障碍症患者的易感等位基因。李晶等[16]研究发现rs9722的T等位基因可能与肠道病毒71型(EV71)感染的手足口病有关联。Dix等[17]研究发现S100B基因突变与侵袭性曲霉病的发生、发展密切相关。目前，关于S100B基因多态性与SLE的遗传易感性尚未见报道。本研究发现S100B基因rs9984765和rs2186358位点基因型和等位基因在SLE患者组和对照组中的分布差异无统计学显著性，而rs2839356位点的C等位基因携带者与SLE之间的存在相关性，即SLE患者组携带C等位基因频率高于对照组。同时，进一步分析rs2839356等位基因与SLE患者临床表现的关系，发现rs2839356位点C等位基因频率在伴有神经系统病变的SLE患者中高于不伴有神经系统病变的SLE患者。我们的研究结果提示rs2839356位点C等位基因可能在广西地区人群中与并发神经系统病变的SLE患者的易感性相关。由于样本量、种族以及地域是影响基因多态性与疾病易感性的重要因素，而且，SLE 是一种由环境因素和遗传因素共同作用的复杂疾病，由于缺乏足够的有效数据，尚不能开展基因-基因间或基因-环境间的交互作用的探索，因此，下一步我们将对S100B基因SNP与SLE相关在其他种族人群、更大样本量以及基因多态性与研究环境交互作用的广泛研究中验证我们的结果。

综上所述，本研究表明S100B基因rs9984765和rs2186358位点多态性可能与SLE的易感性无关，而rs2839356的C等位基因可能与SLE及其并发神经系统病变的风险具有相关性。其机理可能是该位点基因突变影响了血清S100B的分泌，参与了SLE的发生、发展过程。探究 S100B基因多态性在SLE发病过程中的具体机制，有助于阐明SLE发病分子机制以及发现新的预测评估SLE危险的基因标志，进一步为临床上SLE的诊断、治疗以及预后提供重要的理论依据。