miR-339通过靶向调控IGF2BP1抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖*

洪 雁， 赵 梅

(海南省第三人民医院药学部， 海南 海口 572000)

肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)过度增殖可导致肺血管狭窄或闭塞，是肺动脉高压的最主要特征之一，在肺动脉高压发生发展中起重要作用[1-2]。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一类非编码小RNA，可通过靶向调控mRNA的3’非翻译区(3’-untranslated region，3’-UTR)来调节基因表达[3],参与许多人类疾病的病理生理过程。已有研究表明miR-204、miR-130a、miR-124和miR-424等miRNAs在肺动脉高压PASMCs增殖的调控中发挥重要作用[4-7]。最近的研究发现miR-339在肺动脉高压大鼠中的表达下调[8]，然而miR-339 对 PASMCs的作用机制尚未有非常深入的研究。本研究通过体外实验研究了miR-339对PASMCs增殖的影响并探讨相关的分子机制，为临床更好地治疗肺动脉高压提供理论基础。

材 料 和 方 法

1 主要材料

大鼠肺动脉平滑肌细胞购于Sigma。DMEM-F12培养液及胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购于Thermo Fisher Scientific；血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)购于 Sigma；CCK-8试剂盒购于北京碧云天公司；PCR引物、miR-339 模拟物(miR-339 mimic)、miR-339抑制物(miR-339 inhibitor)以及相应的对照[模拟物阴性对照，mimic negative control(mimic NC); 抑制物对照，inhibitor NC]、胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1，IGF2BP1)过表达质粒(pcDNA3.1-IGF2BP1)以及相应的对照(pcDNA3.1)购于广州锐博生物科技有限公司；Lipofectamine 2000试剂购于Invitrogen；PCR相关试剂购于TaKaRa；Western blot 相关抗体购于Abcam。

2 主要方法

2.1细胞培养 PASMCs于含10% FBS的DMEM-F12培养液中,置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。第6代PASMCs用于实验。

2.2血管紧张素II处理以及细胞转染 利用不同浓度的血管紧张素II (10、100和1 000 nmol/L)分别处理PASMCs 48 h后，使用Lipofectamine 2000试剂，根据说明书对PASMCs进行转染，转染48 h 后的PASMCs被用于进一步的实验。

2.3RT-qPCR实验 使用TRIzol试剂(Invitrogen)提取 PASMCs中的mRNA和miRNA,使用PrimeScript RT试剂盒和One Step PrimeScript miRNA合成试剂盒分别将mRNA和miRNA逆转录成cDNA。按照说明书，使用ABI7300实时PCR系统和SYBR Green方法进行qPCR，反应程序为95 ℃预变性1 min;95 ℃变性10 s、60 ℃退火20 s、70 ℃延伸10 s，40个循环，分别使用GAPDH和U6作为mRNA和miR-339的内参照，利用2-ΔΔCt方法计算miR-339和相关mRNA的相对表达水平。miR-339的上游引物序列为5’-GGGTCCCTGTCCTCCA-3’，下游引物序列为5’-TGCGTGTCGTGGAGTC-3’; PCNA的上游引物序列为5’- TCCTCCTTCCCGCCTGCCTGTAGC-3’,下游引物序列为5’- CGCGTTATCTTCGGCCCTTAGTGTA-3’; IGF2BP1的上游引物序列为5’-CAGGAGATGGTGCAGGTGTTTATCC-3’,下游引物序列为5’- GTTTGCCATAGATTCTTCCCTGAGC-3’; U6的上游引物序列为5’- GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’, 下游引物序列为5’- CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’; GAPDH的上游引物序列为5’-ACCCACTCCTCCACCTTTG-3’,下游引物序列为5’- CACCACCCTGTTGCTGTAG-3’。

2.4CCK-8实验和活细胞计数检测细胞的增殖能力 取经上述处理的PASMCs于96孔平板中培养48 h。弃上清液，每孔加入CCK-8溶液于37 ℃孵育2 h，然后通过酶标仪检测450 nm波长处的吸光度(A)值。将处理后的细胞利用胰酶消化后，利用0.04%台盼蓝对细胞进行染色，TC10细胞计数仪进行活细胞计数,活细胞数=总细胞数-着色的死细胞数。

2.5萤光素酶报告实验 为了构建萤光素酶报告基因载体，将含有miR-339结合位点的IGF2BP1 3’-UTR的野生型(WT)和突变的(MUT)片段克隆到pGL3报告萤火素酶载体中，分别命名为pGL3-IGF2BP1 3’-UTR-WT和pGL3-IGF2BP1 3’-UTR-MUT。将PASMCs与pGL3构建体，以及mimic NC、miR-339 mimic、inhibitor NC和miR-339 inhibitor共转染。在转染48 h后，通过双重萤光素酶测定法测定萤火虫和海肾萤光素酶活性以确定萤光素酶的活性。

2.6Western blot实验 通过使用裂解缓冲液从PASMCs 中提取蛋白，并且通过BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白浓度。通过SDS-PAGE分离蛋白质并转移到PVDF膜上。随后，将PVDF膜用5%脱脂奶在室温下封闭1 h，然后与抗IGF2BP1、p-p38、p38和β-actin抗体 4 ℃孵育过夜，再用PBST洗涤3次；将PVDF膜与HRP接合的 II 抗在室温下孵育2 h。通过ECL试剂盒显示蛋白条带。使用β-actin作为内参照。

3 统计学处理

使用GraphPad Prism 6.0软件进行统计分析。数据以均数±标准差(mean±SD)表示。使用独立样品t检验比较两组数据之间差异；使用单因素方差结合Bonferroni post hoc 检验分析比较多组数据之间差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 血管紧张素II 对PASMCs的增殖以及miR-339表达的影响

CCK-8实验结果示，不同浓度的血管紧张素II处理PASMCs 48 h后，可显著增加PASMCs的活力，且呈浓度依赖性(P<0.01),见图1A。RT-qPCR结果显示血管紧张素II可以浓度依赖性地增加PASMCs的PCNA mRNA表达水平，同时降低miR-339的表达水平(P<0.05,P<0.01),见图1B、1C。

Figure 1.The effect of angiotensin II on cell viability and miR-339 of PCNA and in PASMCs. A:the cell viability was measured by CCK-8 assay; B and C: the mRNA expression of PCNA and miR-339 was detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

图1血管紧张素II对PASMCs的增殖以及miR-339表达的影响

2 miR-339对PASMCs增殖的影响

转染不同miRNA (mimic NC、miR-339 mimic、inhibitor NC和miR-339 inhibitor)48 h后，首先通过RT-qPCR检测了PASMCs中的miR-339的表达水平，结果显示，与mimic NC组相比，miR-339 mimic的转染可以显著增加PASMCs 中的miR-339的表达水平；与inhibitor NC组相比，miR-339 inhibitor的转染可以显著抑制PASMCs中miR-339的表达水平(P<0.01),见图2A。CCK-8实验结果显示，与mimic NC组相比，miR-339 mimic的转染显著抑制PASMCs 的活力；与inhibitor NC组相比，miR-339 inhibitor的转染可以显著促进PASMCs的活力(P<0.05,P<0.01),见图2B。与mimic NC组相比，转染miR-339 mimic显著抑制PCNA的mRNA表达水平；与inhibitor NC组相比，转染miR-339 inhibitor显著促进PCNA的mRNA表达水平(P<0.05,P<0.01),见图2C。细胞计数实验发现miR-339 mimic 转染可以减少PASMCs的活细胞数量，而miR-339 inhibitor 转染可以增加PASMCs的活细胞数量(P<0.05,P<0.01),见图2D。进一步实验发现，与转染mimic NC相比，miR-339 mimic 转染可以抑制血管紧张素II处理后(1 μmol/L， 48 h)的PASMCs细胞增殖，见图2E和2F。

3 IGF2BP1是miR-339的靶点

通过生物信息学软件TargetScan分析发现，miR-339可以作用于IGF2BP1的3’-UTR区域,见图3A；萤光素酶报告实验结果进一步显示，miR-339过表达可以抑制pGL3-IGF2BP1 3’UTR-WT萤光素酶的活性，而miR-339表达下调可以促进pGL3-IGF2BP1-3’-UTR-WT萤光素酶的活性(P<0.01)，见图3B； miR-339的过表达或miR-339的表达下调对pGL3-IGF2BP1 3’-UTR-MUT萤光素酶活性都没有显著影响,见图3C。RT-qPCR 以及Western blot实验结果进一步显示，与mimic NC组相比，miR-339 mimic的转染显著抑制PASMCs 中IGF2BP1 的mRNA和蛋白表达水平；与inhibitor NC组相比，miR-339 inhibitor的转染可以显著促进IGF2BP1的mRNA和蛋白表达水平(P<0.01,P<0.05),见图3D、3E。

4 IGF2BP1上调对PASMCs 增殖的影响

与pcDNA3.1组相比,转染pcDNA3.1-IGF2BP1增加IGF2BP1的mRNA以及蛋白表达水平(P<0.01),见图4A、4B。与pcDNA3.1+mimic NC 组对比，PASMCs 共转染pcDNA3.1+miR-339 mimic 48 h后可以抑制细胞的活力，并降低PCNA的mRNA表达水平(P<0.01);而共转染pcDNA3.1-IGF2BP1+ miR-339 mimic 48 h可以增加细胞的增殖与PCNA的mRNA表达水平(P<0.01),见图4C、4D。为了进一步探讨相关的信号通路，我们将转染mimic NC和miR-339 mimic的PASMCs 利用Western blot 检测了p-p38蛋白以及p38蛋白的水平，结果发现miR-339 mimic 转染可以抑制p-p38蛋白的水平(P<0.01)，对p38蛋白的水平没有影响,见图4E。

Figure 2.The effect of miR-339 on cell proliferation in PASMCs. PASMCs were transfected with mimic NC, miR-339 mimic, inhibitor NC and miR-339 inhibitor. At 48 h after transfection, the relative miR-339 expression (A) was determined by RT-qPCR, the cell viability was measured by CCK-8 assay (B), the mRNA expression of PCNA was detected by RT-qPCR (C), the viable cell numbers were determined by cell counting. Angiotensin II-treated PASMCs were transfected with mimic NC and miR-339 mimic, and at 48 h after transfection, the cell viability (E) and the viable cell numbers(F) were determined by CCK-8 assay, RT-qPCR and cell counting, respectively. NC: negative control. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsmimic NC group;△P<0.05vsAngII+mimicNC.#P<0.05,##P<0.01vsinhibitor NC group.

图2miR-339对PASMCs增殖的影响

讨 论

众所周知，血管平滑肌细胞的异常增殖在诸如动脉粥样硬化、静脉移植失败、血管成形术后再狭窄以及肺动脉高压等心血管疾病的发展中起着重要作用，抑制血管平滑肌的异常增殖可能让我们有更好的途径来预防和治疗这些心血管疾病[9-10]。越来越多的证据表明miRNA在血管平滑肌的增殖中起着关键作用。据报道，miR-339在肺动脉高压大鼠中的表达下调[8]，有学者研究发现miR-339可以通过调控FGF信号通路从而抑制PASMCs的增殖。

血管平滑肌细胞的过度增殖可以被各种细胞因子和生长因子如血管紧张素II、胰岛素和血小板衍生生长因子诱导。研究发现血管紧张素II可以促进PASMCs细胞的增殖[11]，本研究 的CCK-8实验结果发现血管紧张素II可以剂量依赖性地促进 PASMCs的活力。同时，血管紧张素II 促进PCNA(细胞增殖状态的一个指标基因)的 mRNA 在PASMCs 中的表达水平。除此之外，血管紧张素II可以降低miR-339的表达水平，提示miR-339可能参与 PASMCs的增殖过程。在肿瘤的研究中, miR-339 可以抑制结肠癌细胞的增殖以及转移[12]。Jansson等[13]研究发现通过调控MDM2的表达来促进p53信号通路活性来抑制肿瘤细胞的增殖。Wu等[14]发现miR-339可以抑制乳腺癌细胞的增殖以及转移。本研究发现miR-339的过表达可以抑制 PASMCs的活力和活细胞数量，而miR-339的表达下调可以促进PASMCs的活力和活细胞数量，提示miR-339对PASMCs的增殖起到抑制作用。

Figure 3.IGF2BP1 was a direct target of miR-339. A: miR339 acts on the 3’-UTR of IGF2BP1; B and C: PASMCs were co-transfected with miRNAs (mimic NC, miR-339 mimic, inhibitor NC and miR-339 inhibitor) and pGL3-IGF2BP1 3’UTR-WT/pGL3-IGF2BP1 3’-UTR-MUT, and at 48 h after transfection, luciferase activity was measured; D and E: PASMCs were transfected with mimic NC, miR-339 mimic, inhibitor NC or miR-339 inhibitor, and at 48 h after transfection, the mRNA and protein expression of IGF2BP1 was determined by RT-qPCR and Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsmimic NC group;#P<0.05,##P<0.01vsinhibitor NC group.

图3IGF2BP1是miR-339的靶点

本研究通过生物信息学分析发现IGF2BP1是miR-339的一个下游靶点，通过萤光素酶报告实验发现miR-339可以作用于IGF2BP1的3’-UTR，RT-qPCR以及Western blot实验发现miR-339可以负向调控IGF2BP1在PASMCs的表达。IGF2BP1作为一种RNA结合蛋白可以负调控IGF2的mRNA表达，很多研究发现IGF2BP1在多种癌症中起着癌基因的作用，从而促进肿瘤细胞的增殖[15]。此外，IGF2BP1被鉴定为包括miR-494、miR-150和 miR-625等几种miRNA的靶点[16-18]。然而IGF2BP1对PASMCs的增殖作用尚未报道，本研究中我们发现 IGF2BP1的过表达可以部分拮抗miR-339对PASMCs增殖的抑制作用，提示 miR-339对 PASMCs的增殖作用可能有部分是通过对 IGF2BP1的调控。研究发现血管紧张素II可以激活p38 MAPK信号通路从而促进PASMCs的增殖[19]，同时IGF2BP1是p38 MAPK的一个结合蛋白[20]。本研究发现miR-339过表达可以抑制PASMCs中p-p38蛋白的表达，提示miR-339抑制PASMCs的增殖可能与调控p38 MAPK信号通路有关。

Figure 4.The effect of IGF2BP1 overexpression on cell proliferation in PASMCs. A and B: the mRNA and protein expression levels of IGF2BP1 were determined by RT-qPCR and Western blot, respectively; C: the cell viability was determined by CCK-8 assay; D: the mRNA expression of PCNA was determined by RT-qPCR; E: the protein expression levels of p-p38 and p38 were determined by Western blot. NC: negative control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vspcDNA3.1 group;△△P<0.01vspcDNA3.1+mimic NC group;▲▲P<0.01vsmimic NC group;#P<0.05,##P<0.01vspcDNA3.1+miR-339 mimic group.

图4IGF2BP1对PASMCs增殖的影响以及miR-339对p38MAPK信号通路的影响

综上所述，本研究发现miR-339对PASMCs的增殖起到抑制作用，这种抑制作用可能部分通过调控IGF2BP1以及p38 MAKP信号通路来实现的，提示miR-339在肺动脉高血压中起到一定的调控作用。将来有必要进一步进行动物体内试验以及临床试验来确认miR-339在肺动脉高血压中的作用。