盐酸益母草碱对破骨细胞生成的作用及机制研究*

张 怡，田坤明（遵义医学院公共卫生学院，贵州遵义563000）

骨质疏松症是全球公共健康卫生问题。在中国，年龄在60岁以上约有23％左右、80岁以上50％的人被诊断为骨科疾病[1]。骨质疏松症是由于破骨细胞活动增加，导致骨密度降低，从而增加骨折风险[2]。骨密度降低的直接原因就是由于破骨细胞活跃所致的骨吸收效应，超过了成骨细胞的新骨形成速度。

目前，一些中药在抗骨质疏松方面已经取得了显著疗效，包括淫羊藿[3]、女贞子[4]和补骨脂[5]等。女性在绝经后缺少雌性激素会增加破骨细胞的骨吸收能力[6]。盐酸益母草碱（LH）基于益母草碱结构化学合成，于植物益母草中发现[7]。已有文献报道，益母草碱可以提高雌二醇激素水平[8]，但益母草碱对于骨质疏松症的治疗作用及机制仍缺乏报道。本次实验主要探讨LH在体外对破骨细胞的成熟分化影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 LH购自安徽新星药业发展有限公司，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色使用白细胞酸性磷酸酶染色试剂盒购自Sigma公司，核因子κB抑制蛋白（IκBα）、磷脂酰肌醇 3⁃激酶（PI3K）和蛋白激酶 B（Akt）的磷酸化和非磷酸化抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司；小鼠重组核因子κB受体活化因子配体（RANKL）购自PeproTech公司，RAW264.7细胞购于中国科学院细胞库。

1.2 方法

1.2.1 细胞来源及培养 为形成破骨细胞样细胞，将RAW264.7细胞接种在 α⁃MEM培养基并且加入RANKL（100 ng∕mL）4～6 d，接种密度为 1×105。培养条件为5％CO2及37℃无菌环境中。

1.2.2 TRAP染色 RAW264.7细胞先用RANKL处理48 h，然后用不同浓度（0.5、1.0、2.0 μmol∕L）的 LH 处理48 h。随后固定在3.7％多聚甲醛10 min，根据试剂盒说明书进行TRAP染色，在显微镜下3个或4个TRAP核染色阳性的细胞就是破骨细胞。

1.2.3 MTT实验 采用MTT实验检测RAW264.7细胞增殖。将RAW264.7细胞培养在96孔板中，接种密度为每孔0.5×105个，每组并且设置4个副孔。接种24 h之后，分2组处理。第1组用不同浓度LH（0.0、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol∕L）处理 RAW264.7 细胞 48 h。第 2 组用 2.0 μmol∕L LH 处理 RAW264.7 细胞 24、48、72 h。磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）洗涤细胞，每孔RAW264.7细胞中加入20 μL的5 mg∕mL MTT试剂，放在细胞培养箱中培养4 h。丢弃MTT溶液，加入200 μL二甲基亚砜（DMSO）溶液，然后在摇床上摇荡10 min，用酶联免疫检测仪在490 nm处检测吸光度值。

1.2.4 Western blotting实验 取LH干预组（RANKL+LH组）及非LH干预组（RANKL组）细胞，弃掉细胞中培养基，用PBS洗2次。每个小皿加入80 μL裂解液，在冰上裂解 30 min。刮蛋白，离心（13 min、4 °C、13 000 r∕min）收集蛋白裂解液。双环辛酸（BCA）工作液根据0.5 mg∕mL牛血清蛋白（BSA）制备标准曲线，然后检测不同处理细胞蛋白浓度。制备上样蛋白（40 μg）。在8％SDS⁃PAGE凝胶中分离，之后电转到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。PVDF膜用5％脱脂牛奶在室温封闭1 h，PBS洗3次，每次5 min。孵育磷酸化芳香胺N（anti⁃phospho）⁃IκBα、anti⁃phospho⁃PI3K 和 anti⁃phospho⁃Akt抗体，以及非磷酸化的 anti⁃IκBα、anti⁃PI3K 和 anti⁃Akt抗体，甘油醛⁃3⁃磷酸脱氢酶（GAPDH）用作内参。放置于4℃环境，过夜，PBS洗3次，每次5 min。孵育相应的二抗，PBS洗3次，每次5min，最后增强化学发光法（ECL）显影。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，实验数据采用表示，两组间差异比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TRAP染色 RANKL刺激RAW264.7分化为破骨细胞，TRAP染色阳性为多核破骨细胞。在RAW264.7细胞中，TRAP染色表明，与RANKL组比较，不同浓度LH显著抑制破骨细胞分化，差异均有统计学意义（P＜0.01），见图 1A、B。

图1 TRAP对RAW264.7细胞进行染色

2.2MTT实验 MTT实验表明，LH能够显著抑制RANKL诱导的RAW264.7细胞增殖，与对照组（0.0 μmol∕L LH组）比较，其他不同浓度LH组的RAW264.7细胞存活率显著下降，差异均有统计学意义（P＜0.05），并且对RAW264.7细胞抑制作用呈时间、剂量依赖性。见图2A、B。

2.3 Western blotting实验 Western blotting实验结果表明，与对照组（0 min）比较，RANKL 显著上调 p⁃IκBα表达，尤其是在第10分钟，差异有统计学意义（P＜0.01）。在相同处理时间（5、10、15 min），与 RANKL 组比较，LH处理之后可以显著抑制p⁃IκBα的表达，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图 3A、B。

与对照组（0 min）比较，在RANKL处理5、10 min时，显著上调p⁃PI3K和p⁃Akt表达，差异均有统计学意义（P＜0.05）。在相同处理时间（5、10、15、30、60 min），与RANKL组比较，LH处理之后可以显著抑制p⁃PI3K和p⁃Akt表达，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图 3C、D⁃1、D⁃2。

图2 LH对RAW264.7细胞增殖影响

图3 LH对相关蛋白表达的影响

3 讨 论

LH是基于从益母草中提取的益母草结构。在传统中医药中，益母草是广泛用于妇科疾病，例如流产之后子宫异常出血[9]、产后出血[10]及痛经[11]。本研究表明，LH能够明显抑制RANKL介导的破骨细胞形成。在分子机制水平方面，LH抑制RANKL激活的NF⁃κB活性，影响IκBα磷酸化和降解，抑制PI3K∕AKT信号通路的激活。

作者用破骨细胞前体RAW264.7研究LH对破骨细胞形成的影响。在骨髓微环境中，RANKL能够驱使破骨细胞前体分化为成熟破骨细胞[12]，故本研究采用RANKL刺激RAW264.7分化为破骨细胞。而TRAP染色与MTT实验都表明，LH能够显著抑制破骨细胞形成，并且呈剂量、时间依赖性。

核因子κB在RANKL诱导的破骨细胞形成中发挥着重要的作用，缺失核因子κB亚基p50和p52导致骨硬化不能够形成破骨细胞[13]。PI3K∕Akt信号通路可以被RANKL 激活，从而调节破骨细胞生存和分化[14⁃15]。而RANKL 诱导的 Akt又是依赖于 TRAF6⁃Src⁃PI3K∕Akt的相互作用，故本研究探讨了LH对RANKL诱导的RAW264.7细胞中IκBα、PI3K和Akt蛋白磷酸化的影响。结果显示，RANKL诱导的Akt活性对LH极度敏感，LH抑制RANKL介导的PI3K上调。

本研究结果表明，LH可以通过下调IκBα、PI3K和Akt蛋白的磷酸化，从而抑制IκBα、PI3K和Akt蛋白活性，抑制破骨细胞生成。其可能用于临床治疗破骨细胞相关疾病如骨质疏松症等。