在肾细胞癌中Survivin高表达及相关性分析*

秦松林，刘婷，胡威，刘伯龙，唐正，冯聚玲，谭靖（.南华大学附属第一医院泌尿男科，湖南衡阳00；.南华大学附属第一医院手术中心，湖南衡阳00；3.南华大学医学院诊断学教研室，湖南衡阳00；.中南大学湘雅三医院泌尿外科，湖南长沙003）

肾细胞癌（RCC）是临床上较为常见的恶性肿瘤之一，占肾脏肿瘤的 85％～90％[1⁃2]。肾脏不容易受创伤，但是当肾脏出现病变时也不容易被发现。另外，RCC在临床症状上又缺乏特异性。近50％的RCC患者在早期是无任何临床症状的，临床上大部分患者通过体检或检查其他疾病时才被发现。

转移性RCC采用以内科治疗为主的综合性治疗，但疗效欠佳[3]。目前还缺乏特异性的肿瘤标志物来检测RCC，所以早期预测RCC还有较大的困难。因此，筛选RCC发生及复发转移的标志物，对早期发现RCC、有效防治RCC具有非常重要的意义。

细胞凋亡亦称程序性细胞死亡，具有重要的病理生理意义。凋亡失调是许多疾病的发病机制之一，所以通过抑制细胞凋亡，可以防治这些疾病。目前，在所发现的凋亡抑制因子中，存活素（Survivin）的功能最强大。其不但具有抑制细胞凋亡的功能，而且还有调节细胞增殖的作用。Survivin基因位于17q25染色体上，由3个内含子和4个外显子组成，全长大约有14 700个碱基对。

研究表明，在人类胚胎发育的组织中和大多数的恶性肿瘤组织当中都有Survivin的表达，包括胃癌、膀胱癌等，而其在正常成熟组织中表达阴性，具有肿瘤特异性表达的特点[4]。目前，有关Survivin的研究已成为热点。本实验采用荧光定量聚合酶链式反应（PCR）法从mRNA水平上检测RCC组织和正常肾组织中Survivin的表达。本文探讨Survivin与RCC的相关性，期待为早期发现RCC，并且为判断RCC恶性程度提供新手段。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 标本来源 在2010年3月至2011年9月中南大学湘雅三医院泌尿外科收治的RCC患者中随机挑选出63例，将其手术切除的RCC标本作为研究组，另取其相应的远离肿瘤组织的正常肾组织作为对照组，取自距离肿瘤组织5 cm以上。63例患者中男36例，女27例；年龄28～75岁，平均（54.0±8.3）岁。所有患者均行 RCC 根治术，术后病理证实均为RCC。临床分期：Ⅰ、Ⅱ期28例，Ⅲ、Ⅳ期35例[参照《2011版中国泌尿外科疾病诊断治疗指南》中推荐采用的2002年美国肿瘤研究联合委员会（ATCC）肾癌临床分期方法]；病理分级：高分化30例，中分化21例，低分化12例[参照《2011版中国泌尿外科疾病诊断治疗指南》中推荐采用的2004年世界卫生组织（WHO）病理分级方法]。将最终实验结果与RCC各临床病例参数的关系进行统计学分析。

1.1.2 主要试剂及仪器 PCR引物（英韦创津生物公司，广州，中国），DNA Marker，RevertAidTM First Strand cDNA 合成试剂盒（Fermentas，Maryland，USA）；PCR热循环仪、低温微量离心机（Eppendorf，Hamberg，Germany）。

1.2 方法 采用荧光定量PCR，提取2组RCC组织和癌旁正常组织总RNA，并用DNA酶Ⅰ处理后进行定量分析，2组取等量的总RNA反转录成cDNA后，进行荧光定量PCR检测。具体程序如下：预变性95℃，30 s，20℃，1个循环；PCR 反应 95℃，5 s，20℃，60℃，34 s，20℃，40个循环，72℃，34 s，20℃，40个循环。

1.3 统计学处理 以人胚肾细胞系HEK293为参照细胞系，β⁃actin 作为内参基因，根据通用的 2⁃△△CT方法，Survivin△CT∕β⁃actin△CT 计算样本中 Survivin 的相对表达量。应用SPSS21.0统计软件对数据进行分析，计数资料以率或构成比表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2组RCC组织和正常肾组织中Survivin mRNA表达情况比较 研究组RCC组织中Survivin mRNA高表达阳性51例（80.95％）。对照组正常肾组织中未发现Survivin mRNA高表达阳性。Survivin mRNA在研究组RCC中的阳性表达率明显高于对照组正常肾组织，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表 1。

表1 2组RCC组织和正常肾组织中Survivin mRNA表达情况比较

2.2 不同临床分期RCC中Survivin mRNA表达情况比较 Survivin mRNA在Ⅲ、Ⅳ期RCC中阳性表达率明显高于Ⅰ、Ⅱ期RCC，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 不同临床分期RCC中Survivin mRNA表达情况比较

2.3 不同病理分级RCC中Survivin mRNA表达情况比较 Survivin mRNA在低、中分化RCC中阳性表达率明显高于高分化RCC，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 不同病理分级RCC中Survivin mRNA表达情况比较

2.4 Survivin mRNA在RCC中的表达与淋巴结转移的关系 Survivin mRNA在35例有淋巴结转移的RCC中阳性表达30例（85.71％），在28例无淋巴结转移的RCC中阳性表达15例（53.57％）。Survivin mRNA在有淋巴结转移的RCC中阳性表达率明显高于无淋巴结转移 RCC，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 4。

表4 Survivin mRNA在RCC中的表达与淋巴结转移的关系

3 讨 论

筛选RCC发生及复发转移的标志物对早期发现RCC，进而早期诊治RCC具有非常重要的意义。在已知多种癌前病变中，均有Survivin的表达。包括结肠息肉、乳腺腺瘤、博文氏病、肥厚性光化性角化病[5]。

王克文等[6]使用荧光定量PCR法检测38例食管癌中 Survivin mRNA的表达情况。结果显示，Survivin mRNA阳性表达率为73.68％，且与肿瘤恶性程度有关，而与食管鳞癌患者的年龄、性别、淋巴结转移无显著性关系。在恶性黑色素瘤的基因表达上，有许多角色参与调控其细胞增殖、DNA修复。作为凋亡相关基因，Survivin在恶性黑色素瘤细胞质与细胞核中均可以被检测出，而在良性或发育不良痣上无表达[7]。研究发现，Survivin的核表达可以预测恶性黑色素瘤的复发[8]。Sur⁃vivin表达与膀胱肿瘤的临床分期、病理分级有着密切关系，并且是早期复发的重要预测因子。李守宾等[9]用免疫组织化学检测了45例前列腺恶性肿瘤组织和50例良性前列腺组织中Survivin的表达，结果发现，在45例前列腺癌组织中，共有37例表达阳性，阳性率为82.2％；在50例良性前列腺组织中，仅有6例表达阳性。其中在前列腺癌组织中，Survivin的阳性表达率及表达强度与Gleason评分呈正相关，即在Gleason低分化组中的表达显著低于高分化组。WANG等[10]应用免疫组织化学方法检测24例RCC组织中的Survivin水平，结果显示Survivin的表达与肿瘤的恶性程度、分级、分期、淋巴转移呈正相关。

本研究采用荧光定量PCR法检测肾组织中的Sur⁃vivin mRNA水平表达，结果显示，63例RCC组织中Survivin mRNA高表达阳性为51例（80.95％），正常组织未发现mRNA阳性表达。本研究通过mRNA水平证实了Survivin在RCC中的高表达，在正常肾组织中不表达。通过本研究结果可以看出，Survivin只选择性高表达于RCC组织中，而在正常肾组织中的表达为阴性。在RCC的发展与演变过程中，Survivin可能起到了举足轻重的作用。

进一步研究Survivin的表达与RCC的关系，Sur⁃vivin mRNA在中、低分化RCC表达阳性率均显著高于高分化RCC。Survivin mRNA在有淋巴结转移的RCC中高表达阳性。这表明Survivin的表达与RCC的恶性程度有密切关系，可能参与了RCC的临床进展。

Survivin是RCC一个独立危险因素，与RCC的复发、预后密切相关。在RCC的各个时期均能够检测出Survivin的阳性表达，可以认为Survivin可能在RCC发生早期中起作用，在胰腺癌、结肠癌中同样有类似的研究 [11⁃12]。

综上所述，Survivin有望成为判断RCC转移和预后等生物学行为的重要指标，将有可能成为肿瘤治疗的新靶点。