补骨脂素对骨质疏松小鼠骨折修复的影响*

黄奎 伍国锋 邹季*

骨质疏松不仅导致骨脆性增加骨折发生风险上升，同时亦影响骨折的愈合过程和结果，表现为骨痂形成量减少、骨折愈合质量不佳和生物力学性能下降[1]。在中医药的使用过程中，发现了一些能促进性腺功能和骨折愈合的药物。补骨脂素是常用补肾中药补骨脂中提取的一种有效活性成分，属于呋喃香豆素类化合物的植物雌激素。我们前期研究结果显示补骨脂素灌胃治疗可改善骨质疏松小鼠骨微观结构和生物力学性能[2]。本实验拟通过钼靶 X线、组织学和生物力学等检测方法，观察补骨脂素对骨质疏松小鼠骨折修复的影响。

1 实验材料

1.1 骨质疏松小鼠造模

30只12周龄雌性C57BL/6小鼠，购买于湖北省实验动物研究中心，平均体重（20.8±1.6）g。使用随机数字表法，把30只C57BL/6J小鼠分为两组，其中去卵巢组25只，假手术组5只。去卵巢组，行经腹双侧卵巢切除，而假手术组在暴露卵巢后仅切除卵巢周围少量脂肪组织。

1.2 实验分组和骨质疏松骨折模型建立

骨质疏松小鼠造模6周后，去卵巢组和假手术组各取5只，小鼠股骨远端HE染色确认骨质疏松造模结果。在确定去卵巢骨质疏松造模成功后，20只去卵巢组随机分为2组：模型组和补骨脂素组，每组10只。所有小鼠在右侧股骨中段建立横形骨折，并用0.55mm直径静脉注射器针头作为髓内钉固定。

1.3 给药方法

骨折术后第1天，通过药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算公式和根据我们以往的研究结果[2,3]，补骨脂素组按20mg/kg/d体重量灌胃，每天一次，连续21天，模型组以等剂量生理盐水灌胃。

1.4 检测方法

文献数据显示正常小鼠股骨骨折愈合过程为3天时血肿形成，7天开始新骨形成，10天为软骨痂形成高峰期，10～14天软骨痂开始向硬骨痂转换，21天骨折基本愈合[4-6]。

1.4.1 钼靶X线

术后21天，每组随机选取5只小鼠，小鼠拍摄右侧股骨侧位片（曝光条件：39kV，400mA，32ms），将中心聚焦在右侧股骨骨折水平，在 DirectView（caresteream锐珂医疗）工作站采取原始图像数据，在图像4倍放大率下，作骨痂生成面积测定[7](AdobePhotoshopCS4图像分析应用软件美国)。

1.4.2 骨痂组织学

股骨标本在钼靶 X线检测后，甲醛固定，放入 10%EDTA溶液中，在37℃的温箱脱钙2周。常规脱水、透明和石蜡包埋，苏木精-伊红（hematoxylin-eosinstaining,HE）染色，使用光学显微镜观察骨折愈合情况。

1.4.3 生物力学

随机取5只小鼠在术后21天处死，取右侧股骨行3点弯曲测试。测试时将所有股骨常温解冻，在取出后12小时内进行测试。加载点位于股骨中段中点前侧骨皮质骨折线处，两支点中间间距为10mm，设定加载速度为5 mm/min，其股骨后侧骨皮质为张力侧。使用精密游标卡尺，测量小鼠股骨横截面内外径的最大和最小值，根据以往实验文献方法[8]计算出最大载荷和最大应力并进行统计学比较。

1.5 试剂和主要仪器

补骨脂素（江苏永健医药公司），钼靶X光机（西门子，德国），生物力学测试机（Instron-8841，美国），TAIVA TB-718EL生物组织自动包埋机（泰维医疗科技有限公司，中国）TK-218V恒温摊片烤片机（鸿迈医疗器械有限公司中国），TC-120C生物组织自动脱水机（斯欧医疗仪器公司，中国），LeicaRM2135石蜡切片机（LEICA，德国），Olympus BX-51显微镜（Olympus，日本）。

1.6 统计方法

应用SPSS19.0统计学软件（SPSS公司，美国）进行分析，计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析。＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨质疏松小鼠模型的确认

骨质疏松小鼠造模6周后，假手术组小鼠干骺端骨小梁致密较宽且粗细均匀，排列整齐，髓腔大小正常。去卵巢组小鼠，骨小梁变细，密度稀疏、间距变宽，髓腔宽大。对比两组小鼠股骨远端骨质形态证明骨质疏松小鼠造模成功（见图1，2，彩图见插页）。

图1，造模术后6周假手术组股骨远端HE染色，40X。

图2，造模术后6周去卵巢组股骨远端HE染色，40X。

2.2 钼靶X线结果分析

骨折术后第21天，模型组骨折线清晰，骨痂未填满骨折断端，骨折未愈合；补骨脂素组较模型组骨痂密度变高、骨折线模糊，基本愈合（见图3，4）。使用图像分析应用软件，比较2组小鼠骨痂形成面积显示：两组骨痂生成面积比较无明显差异（见表1）。

图3，术后21天模型组股骨骨折X线。

图4，术后21天补骨脂素组股骨骨折X线。

表1 ，术后21天骨痂形成面积比较＞0.05。

表1 ，术后21天骨痂形成面积比较＞0.05。

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2.3 骨痂HE染色分析

模型组术后21天，仍有可见大量软骨细胞，部分钙化，有少量编制骨。补骨脂素组术后21天软骨细胞较模型组明显减少，成骨细胞增生较活跃，软骨骨化形成编织骨（见图5，6，彩图见插页）。对 2组切片中的破骨细胞进行观察，补骨脂素组破骨细胞密度更稀疏，但两组在骨痂表面都有破骨细胞的存在，破骨细胞紧密的附着在骨质表面似乎正在吸收骨质，破骨细胞形态和细胞核数量未见明显差异（见图7，8，彩图见插页）。

图5，术后21天模型组骨痂HE染色，40X（左），200X（右）。

图6，术后21天补骨脂素组骨痂HE染色，40X（左），200X（右）。

图7，术后21天模型组破骨细胞HE染色，200X。

图8，术后21天补骨脂素组破骨细胞HE染色，200X。

2.4 生物力学分析

表2 ，术后21天最大载荷比较，*＜0.05。

表2 ，术后21天最大载荷比较，*＜0.05。

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表3 ，术后21天最大应力＞0.05。

表3 ，术后21天最大应力＞0.05。

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3 讨论

治疗骨质疏松骨折时首要的目标是预防骨折延迟愈合，除在改善手术方式和手术中应用更新的手术器械、增加螺钉把持力以外，还需要采用综合措施改善体内骨折愈合环境，促进骨折愈合并且预防再次骨折的发生。尽管，目前使用的几种经典的抗骨质疏松药物可以减少骨量丢失和骨折危险性的发生，但它们对骨质疏松骨折愈合的影响尚不完全明确并存在争议。现有学者开始关注因长期使用双膦酸盐过度降低骨转化水平而对骨折愈合导致的不良影响[9,10]。

肾虚在中医里被认为是所有骨与关节疾病的根源，肾虚导致机体退变的重要因素，可引起发育障碍、骨骼脆弱等表现例如骨质疏松和关节炎等。长久以来在我国和东南亚国家，补肾中药已被用于治疗各种骨伤科疾病，并积累了丰富的临床经验[11]。现在新药开发者已将目光投向通过现代生物学、化学和药学的方法从传统天然中草药中甄别和获得能治疗骨质疏松和骨折的有效成分[12]。补骨脂素是补骨脂中提取的一种有效活性成分，属于呋喃香豆素类化合物的植物雌激素。因雌激素受体在骨组织的广泛分布，导致植物雌激素可做为一种治疗骨质疏松症潜在的天然活性药物。研究表明植物雌激素能抑制破骨细胞的增殖和分化，减少抗酒石酸酸性磷酸酶的表达和吡啶啉的分泌，并增加骨形成，提高骨密度，碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白和I型胶原水平，从而降低骨转换水平和提高骨生成率[13]。

补骨脂素能通过MAPK-NF-kB信号和BMPs信号通路激活成骨细胞，增加成骨[14,15]。本实验结果中，与模型组比较，补骨脂素组表现出对骨质疏松小鼠骨折修复有改善作用。与模型组比较，补骨脂素组骨痂X线密度更高，HE组织学中成骨细胞活跃，较多编织骨形成。比较两组小鼠骨痂形成面积无明显差异，结合生物力学分析，最大载荷是骨结构力学指标，表现的是骨结构力学特性[16]，不仅与骨组织本身的材料特性有关，也受骨的尺寸和几何形状的影响。最大应力是骨组织材料力学性能指标，受骨组织内骨矿盐含量和胶原纤维走向等骨基质成分变化的影响。提示补骨脂素增加骨痂内矿化程度，骨折愈合质量增加。

我们前期研究中[2]，补骨脂素作为一种植物雌激素，与雌二醇作用类似，能明显降低去卵巢骨质疏松小鼠的血清I型胶原羧基末端肽水平，提示补骨脂素对破骨细胞有一定的抑制作用。破骨细胞对骨痂重塑至关重要[17,18]，在本次对骨痂组织HE染色的病理检测中，同时观察到2组骨痂表面均有破骨细胞存在，而破骨细胞形态和细胞核分叶的数量并未见明显差异、破骨细胞成熟度相当，提示补骨脂素没有对破骨细胞进行过度抑制，亦未影响骨痂塑形过程。

综上所述，补骨脂素作为一种植物雌激素能有效改善骨质疏松小鼠骨痂愈合质量和生物力学性能。但本实验也存在一些不足，首先，我们仅使用了单一剂量的补骨脂素，其量效关系和补骨脂素改善骨质疏松骨折愈合的具体机制还需进一步研究。另外，骨折早期愈合并不包含完整的骨折塑形过程，补骨脂素作为植物雌激素所表现出的抑制破骨细胞的作用对骨痂整个塑形过程的影响也需进一步的观察。