微小RNA-132和高迁移率族蛋白1在脓毒症患儿外周血单个核细胞中的表达及临床意义

张 翠

（肥城矿业中心医院检验科，山东 肥城 271608）

脓毒症是由多种因素导致的全身炎症反应综合征，为儿科监护室的常见危重症，，病情进展迅速，若不能尽早诊断和治疗，可导致休克、多系统多器官衰竭，甚至死亡，是导致患儿死亡的主要因素[1]。微小RNA（microRNA，miRNA）作为广泛存在于机体内的短链非编码RNA，在调控细胞生长、器官发生、免疫反应中发挥着重要作用[2]。有研究指出miR-132参与了脂多糖诱导大鼠肺泡巨噬细胞炎症反应[3]。高迁移率族蛋白1（high-mobility group box-1 protein，HMGB1）作为一种重要的促炎症因子，在介导炎症损伤中发挥着重要作用[4]。本研究拟对脓毒症患儿外周血单个核细胞中miR-132和HMGB1 mRNA的相对表达水平进行检测，并探讨其与患儿预后的关联，以期为脓毒症机制研究提供基础资料。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2015年5月—2016年6月在山东省肥城矿业中心医院住院治疗的脓毒症患儿87例，其中男58例、女29例，年龄3个月～5岁，均符合儿童脓毒症诊断标准[5]。排除标准：伴有心、肝、肾等重要脏器功能不全者，以及先天性心脏病者；具有严重药物过敏史、治疗配合不佳者。根据患儿预后情况分为死亡组和非死亡组，其中死亡组25例（男15例，女10例），年龄（2.08±0.25）岁，非死亡组62例（男43例，女19例），年龄（2.17±0.26）岁。选取同期山东省肥城矿业中心医院儿保中心健康儿童50名作为对照组，其中男29例、女21例，年龄3个月～5岁。脓毒症患儿和对照组性别、年龄等一般情况差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究通过山东省肥城矿业中心医院医学伦理委员会批准，所有研究对象的监护人均知情同意。

1.2 方法

所有脓毒症患儿于确诊后进行全身性感染相关性器官功能衰竭（sepsis-related organ failure assessment，SOFA）评分。分别抽取脓毒症患儿确诊后12 h内和对照组体检当日空腹静脉血3 mL，置于乙二胺四乙酸二钾抗凝管内，通过密度梯度法分离单个核细胞。将等体积的生理盐水加入全血中进行稀释，取已稀释好的血液缓慢加在淋巴细胞分离液（美国Sigma公司）之上，800×g离心20 min，留取中间白色环状层液体，加入生理盐水混合均匀，3 000×g离心10 min，弃上清，留取细胞以备检。加入细胞裂解液裂解，利用Trizol总RNA提取试剂盒（美国Invitrogen公司）对单个核细胞中总RNA进行提取，并检测总RNA纯度。取1 μg总RNA用逆转录试剂盒（日本TaKaRa公司）逆转录为模板链，采用LightCycler 480荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪进行扩增，按照荧光定量PCR试剂盒（日本TaKaRa公司）说明书进行操作。引物序列由上海生工生物公司设计合成。miR-132引物：上游5'-GCCCGTAACAGTCTACAGCCAT-3'，下游5'-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；U6引物：上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；HMGB1引物：上游5'-ACATCCAAAATCTTGATCAGTTA-3'，下游5'-AGGACAGACTTTCAAAATG-TTT-3'；β-actin引物：上游5'-AGCGAGCATCC-CCCAAAGTT-3'，下游5'-GGGCACGAAG-GCTCATCATT-3'。PCR反应条件：95 ℃ 1 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，连续循环38次，每个样品均设置3个平行反应复孔。用2-ΔΔCt法计算外周血单个核细胞中miR-132和HMGB1 mRNA相对表达量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 脓毒症患儿和对照组外周血单个核细胞中miR-132和HMGB1 mRNA相对表达水平的比较

脓毒症患儿外周血单个核细胞中miR-132和HMGB1 mRNA相对表达量均高于对照组（P＜0.05）；死亡组患儿外周血单个核细胞中miR-132和HMGB1 mRNA相对表达量均高于非死亡组和对照组（P＜0.05）。见表1。

2.2 脓毒症患儿外周血单个核细胞中miR-132和HMGB1 mRNA相对表达水平的相关性

表1 脓毒症患儿和对照组外周血单个核细胞中miR-132和HMGB1 mRNA相对表达水平的比较 （±s）

表1 脓毒症患儿和对照组外周血单个核细胞中miR-132和HMGB1 mRNA相对表达水平的比较 （±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与非死亡组比较，△P＜0.05

组别 例数 miR-132 HMGB1 mRNA脓毒症患儿 87 1.59±0.24* 1.63±0.11*死亡组 25 1.90±0.21*△ 1.71±0.12*△非死亡组 62 1.47±0.11* 1.59±0.09*对照组 50 1.27±0.14 1.12±0.08

Pearson相关分析显示，脓毒症患儿外周血单个核细胞中miR-132相对表达量与HMGB1 mRNA相对表达量呈正相关（r=0.521，P＜0.001）。

2.3 脓毒症患儿外周血单个核细胞中miR-132和HMGB1 mRNA相对表达水平与SOFA评分的相关性

Pearson相关分析显示，脓毒症患儿外周血单个核细胞中miR-132和HMGB1 mRNA相对表达量均与SOFA评分呈正相关（r=0.438，0.507，P＜0.001）。

2.4 miR-132和HMGB1 mRNA相对表达水平在预测患儿预后中的价值

ROC曲线分析显示，miR-132相对表达量在预测患儿预后时，曲线下面积（area under curve，AUC）为0.921，95% 可信区间（confidence interval，CI）为0.853～0.989，临界值为1.57时，敏感性为84.0%，特异性为87.1%；HMGB1 mRNA相对表达量在预测患儿预后时，AUC为0.858，95%CI为0.769～0.947，临界值为1.72时，敏感性为68.0%，特异性为90.3%；二者联合检测在预测患儿预后时，AUC为0.941，95%CI为0.878～1.000，敏感性为88.0%，特异性为91.9%。见图2。

3 讨论

图2 miR-132和HMGB1表达预测患儿预后的ROC曲线

脓毒症作为由多种因素引起的全身炎症反应，是儿科最常见的危重症。近年来，发病率呈逐年升高趋势[6]。目前，脓毒症具体发生机制尚未完全清楚。有研究指出，脓毒症病情进展甚至死亡与机体炎症反应及免疫功能紊乱密切相关[7]。miRNA作为广泛存在并参与机体多项生理功能的高度保守的短链RNA，可稳定存在于机体中，但当机体受内、外环境影响或多种疾病早期时，其表达便可改变[8]，已成为多种疾病早期诊断及预后评估的指标[9]，对脓毒症诊断及预后具有评估价值[10]，且miRNA参与调控了炎症反应及免疫过程[11]。有研究指出，miR-132在调节炎症反应及免疫抑制中发挥重要作用[12]。HMGB1作为广泛存在、高度保守的DNA结合蛋白，是一种新型炎症介质，在介导炎症所致多种损伤中发挥关键性作用[13]。本研究分析了脓毒症患儿外周血单个核细胞中miR-132和HMGB1表达，结果显示与对照组相比，脓毒症患儿外周血单个核细胞中miR-132和HMGB1 mRNA相对表达量均升高，说明miR-132和HMGB1在脓毒症患儿外周血单个核细胞中呈高表达，提示miR-132和HMGB1可能参与了脓毒症患儿发病。

本研究结果显示，死亡组患儿外周血单个核细胞中miR-132和HMGB1 mRNA相对表达量均高于非死亡组，说明miR-132和HMGB1可能与患者预后有关。同时也从另一方面提示外周血单个核细胞中miR-132和HMGB1表达与患者病情严重程度有关。Pearson相关分析显示，脓毒症患儿外周血单个核细胞中miR-132相对表达量与HMGB1 mRNA相对表达量呈正相关，说明miR-132和HMGB1可能共同参与了脓毒血症患儿发病过程。SOFA评分是目前临床上常用的描述器官功能不全或衰竭发展过程的指标，是评估患者病情及预测预后的重要指标[14]，本研究结果显示，脓毒症患儿外周血单个核细胞中miR-132和HMGB1 mRNA相对表达量均与SOFA评分呈正相关，说明脓毒症患儿外周血单个核细胞中miR-132和HMGB1 mRNA相对表达水平可作为评估脓毒症患儿病情的客观指标。ROC曲线分析结果显示，miR-132表达量在预测患儿预后时，AUC为0.921，敏感性为84.0%，特异性为87.1%，HMGB1 mRNA表达量则分别为0.858、68.0%和90.3%，说明外周血单个核细胞中miR-132和HMGB1表达量可作为评估患儿预后的指标，尤其是二者联合检测时，预测的敏感性和特异性均增加，分别为88.0%和91.9%。

综上所述，miR-132和HMGB1在脓毒症患儿外周血单个核细胞中表达升高，且与患儿预后有关，可作为早期评估患儿预后的指标，对判断患儿病情严重程度及预后具有一定的参考意义。