经导管肝动脉化疗栓塞术肝癌患者外周血淋巴细胞亚群与预后的相关性

孟志民， 朱 捷， 张春燕， 郭 玮， 潘柏申， 王蓓丽

（复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是病死率最高的恶性肿瘤之一。我国每年约有38.3万人死于肝癌及其并发症，占全球肝癌死亡数的51%[1]。在全球范围内，肝癌的发病率逐年攀升。据估计，到2025年，每年肝癌的发病数将超过100万例[2]。手术切除是目前治疗肝癌的唯一根治性手段。当肿瘤已发生转移不宜进行手术时，常会选择非手术手段对疾病进行干预，如经导管肝动脉化疗栓塞（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）术。TACE术的治疗原理是将导管插入肿瘤供血动脉后，使用栓塞剂将靶动脉封闭，从而使肿瘤组织缺血坏死，缩小肿瘤。但TACE术的预后却因人而异，其原因之一是患者自身免疫状况不同。机体的免疫情况与肿瘤的发生、发展有密切联系，免疫细胞能直接参与肿瘤炎症微环境的形成及肿瘤细胞的免疫监视、逃逸[3-4]。使用流式细胞术检测外周血中淋巴细胞亚群的分布可以有效地反映人体免疫状况。鉴于肝癌患者TACE术后尚无有效的标志物对预后进行有效的判断，本研究拟分析肝癌患者外周血淋巴细胞亚群分类与TACE术预后之间的关系。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2015年7月—2016年6月至复旦大学附属中山医院就诊并行TACE术治疗的肝癌初诊患者214例，其中男183例、女31例，年龄38～67岁。肝癌依据国家卫生计生委2011年版《原发性肝癌诊疗规范》诊断，术前未接受过放疗、化疗等相关治疗。入选标准：年龄≥18岁，明确诊断为HCC。排除标准：（1）有其他肿瘤病史；（2）合并有其他恶性肿瘤；（3）入院前经过外院治疗。

患者预后情况判断：患者经TACE术治疗，6个月后行磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）检查，由2位影像学医师对患者的MRI资料进行双盲审查。预后情况分为疾病进展（progressive disease，PD；靶病灶最大径之和至少增加≥20%，出现新病灶）、疾病稳定[stable disease，SD；靶病灶最大径之和缩小未达部分缓解（partial response，PR），或增大未达PD]、PR（靶病灶最大径之和减少≥30%，至少维持4周）、完全缓解（complete response，CR；所有靶病灶消失，无新病灶出现，且肿瘤标志物正常，至少维持4周）。因本研究入组人群无CR者，故将PR和SD者归为疾病稳定组（134例），PD归为疾病进展组（80例）。

收集所有患者的一般临床资料。疾病稳定组与疾病进展组之间一般临床资料差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 疾病稳定组与疾病进展组一般临床资料的比较 （例）

1.2 检测方法

采集所有患者术前乙二胺四乙酸抗凝全血样本。采用FACS Canto Ⅱ流式细胞仪（美国BD公司）及配套6色TBNK试剂盒检测淋巴细胞亚群。取全血样本50 μL与20 μL抗体[CD3-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/CD16-藻红蛋白（phycoerythrin，PE）/CD56-PE/CD45-多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物-花青苷5.5（peridinin-chlorophyll-protein complex-cyanin 5.5，PerCP-Cy 5.5）/CD4-藻红蛋白-花青苷7（phycoerythrin- cyanin 7，PE-Cy 7）/CD19-别藻蓝蛋白（allophycocyanin，APC）/CD8-别藻蓝蛋白-花青苷 7（allophycocyanin- cyanin 7，APC-Cy 7）]混匀孵育15 min，加入红细胞裂解液450 μL，混匀孵育10 min，然后上机检测。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0和Graph prism 5.0软件进行统计分析。呈正态分布的数据以±s表示，组间比较采用配对t检验。采用Logistic回归分析评估患者临床信息与检测指标之间的关系及肝癌患者TACE术预后的危险因素。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌患者TACE术前淋巴细胞亚群分析

疾病稳定组CD4+细胞百分比、CD4+CD8+细胞百分比和CD4+/CD8+比值均明显低于疾病进展组（P＜0.05），而CD19+细胞百分比、CD3+细胞百分比、CD8+细胞百分比和CD56+细胞百分比差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 疾病进展组与疾病稳定组淋巴细胞亚群分类比较 （±s）

表2 疾病进展组与疾病稳定组淋巴细胞亚群分类比较 （±s）

组别 例数 CD19+细胞（%） CD3+细胞（%） CD4+细胞（%）疾病稳定组 134 15.52±7.80 65.24±10.87 39.69±7.01疾病进展组 80 14.96±6.39 67.51±9.37 42.97±8.18 P值 0.569 0.122 0.002组别 CD8+细胞（%） CD56+细胞（%） CD4+CD8+细胞（%） CD4+/CD8+比值疾病稳定组 22.79±7.67 16.55±7.81 2.31±1.45 1.99±0.96疾病进展组 21.13±6.52 14.40±7.52 3.10±2.29 2.29±1.08 P值 0.109 0.051 0.003 0.031

2.2 肝癌患者预后的二元Logistic回归分析

根据第75百分位数将CD4+细胞百分比、CD4+CD8+细胞百分比及CD4+/CD8+比值各分为2组：＜46%组和≥46%组、＜3%组和≥3%组、＜2.5组和≥2.5组。单因素回归分析显示：性别、肿瘤数量、CD4+细胞百分比、CD4+CD8+细胞百分比与TACE术后肝癌患者的预后存在关联[比值比（odds ratio，OR）值分别为0.432、1.978、2.896、1.293，95%可信区间（confidence interval，CI）分别为0.200～0.934、1.123～3.484、1.531～5.478、1.080～1.593]。多因素回归分析显示肿瘤数量、CD4+细胞百分比和CD4+CD8+细胞百分比是TACE术后肝癌患者预后的独立危险因素（OR值分别为1.931、3.096、2.105，95%CI分别为1.058～3.526、1.584～6.052、1.079～4.108）。见表3。

2.3 不同CD4+CD8+及CD4+细胞百分比的患者在疾病稳定组和疾病进展组中的比例

表3 肝癌患者预后的二元Logistic回归分析

疾病稳定组中CD4+细胞百分比≥46%者占17.16%，CD4+CD8+细胞百分比≥3%者占19.40%，均明显低于疾病进展组（37.50%、33.75%）（P＜0.05）。见图1、图2。

3 讨论

图 1 不同CD4+CD8+细胞百分比患者在疾病稳定组和疾病进展组中的比例

图 2 不同CD4+细胞百分比患者在疾病稳定组和疾病进展组中的比例

肝癌是世界范围内高发的恶性肿瘤之一。使用手术方式将癌变组织及肿瘤切除是肝癌治疗的首选方法，但有近40%的中晚期患者因为肿瘤过大或已发生播散转移，不适合使用切除术[5]，转而依据BCLC评分以及患者自身状况，选择TACE术或射频消融术对肿瘤进行干预性治疗。有部分患者在TACE术后肿瘤依然持续性进展，这与患者自身的免疫状况有关。

T淋巴细胞亚群是人体免疫系统中最主要的抗肿瘤免疫方式[6]。T淋巴细胞可依据表面标志物的差异分为CD4+细胞及CD8+细胞，两者在机体免疫中发挥着不同的作用。活化的CD4+细胞通过分泌多种细胞因子提升其他免疫细胞的免疫功能，如促进B细胞分泌抗体、刺激自然杀伤细胞分泌γ-干扰素（interferon gamma，IFN-γ）等，从而激活机体整体的免疫反应，CD4+细胞可以进一步分为辅助性T细胞（T helper cell，Th）1细胞、Th2细胞以及Th17细胞，它们可分泌不同的细胞因子介导炎症反应，在抵御感染、肿瘤、自身免疫性疾病中发挥作用。CD8+细胞通过Fas-FsaL途径、穿孔素、IFN-γ、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）等直接杀伤靶细胞，是抗肿瘤免疫中最主要的免疫细胞。本研究结果显示，疾病进展组CD4+细胞百分比及CD4+/CD8+比值均高于疾病稳定组（P＜0.05）。表明在肿瘤进展过程中，人体内存在明显的免疫炎症反应，随着肿瘤负荷的增加，炎症程度也进一步增强，机体处于免疫激活状态。侯恩存等[7]比较了肝癌患者TACE术术前与术后淋巴细胞亚群的比例，结果显示TACE术后，随着肿瘤负荷的减轻，人体内淋巴细胞亚群的比例也逐渐恢复至较为正常的水平。

CD4+CD8+细胞是一类具有独特免疫功能的T淋巴细胞[8]，可以在炎症及肿瘤免疫中发挥作用。QUANDT等[9]认为这类细胞同时具有CD4+及CD8+细胞的特性，可以分泌白细胞介素（interleukin，IL）21、IL-4和IFN-γ等细胞因子，在机体免疫的过程中发挥着独特的作用。DESFRANCOIS等[10-11]的研究结果显示肿瘤浸润的CD4+CD8+细胞可以分泌IL-13、IL-4和TNF-α，直接作用于肿瘤细胞，抑制其生长并将其杀死。WANG等[12]的研究结果显示，肝癌患者的CD4+CD8+细胞会异常表达STAT3磷酸化蛋白，能促进IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-10分泌，在炎症及肿瘤的发生、发展中起重要作用。另外，其他类型的免疫细胞也与肿瘤有关。PAN等[13]的研究结果显示，采用过继免疫疗法在患者体内输注细胞因子诱导的杀伤（cytokineinduced killer，CIK）淋巴细胞可以有效抑制肝癌的进展，延缓或阻止肿瘤切除术后肝癌的复发。ZHENG等[14]的研究结果显示，肝癌患者的CXCR3+效应T细胞及CD62L+T细胞在经TACE术治疗后会明显升高，提示其与肿瘤相关。不同亚类的T细胞在抗肿瘤方面具有不同的作用。CD4+CD8+细胞作为近几年来新发现的一类细胞，其在肿瘤发生、发展过程中的具体机制尚不明确，值得进一步研究。

综上所述， TACE术前CD4+CD8+细胞百分比是肝癌预后不良的独立危险因素，可作为一种潜在的指标辅助临床判断肝癌患者TACE术的预后。本研究也存在一定的不足之处：（1）未进一步探讨相关的免疫细胞通过何种途径影响肿瘤的发生、发展；（2）仅仅分析了基本的淋巴细胞亚类，未进一步细分是何种类型的T淋巴细胞与肝癌的复发有关。因此，在后续的研究中，我们将进一步对已发现的结果展开分析，完善本研究得出的结论。