上海市鼠伤寒沙门菌单相变异株的鉴定和耐药谱分析

吴 雯，屠丽红，张雯霞，张 曦，陈 敏

（1. 上海市疾病预防控制中心，上海 200336；2. 上海中医药大学附属曙光医院检验科，上海 201203）

鼠伤寒沙门菌是引起食物中毒最常见的致病菌之一，也是重要的医院感染致病菌[1]。20世纪90年代中期，泰国、西班牙等国家首先报道分离出鼠伤寒沙门菌单相变异株，该单相变异株是从鼠伤寒沙门菌进化而来的[2-3]。单相变异株主要指Ⅱ相鞭毛抗原的缺失，可能的分子机制包括Ⅱ相鞭毛抗原编码基因fljB缺失或相关的调控基因如fljA和hin等缺失导致其血清型由4，[5]，12：i：1，2变为4，12：i：-或4，5，12：i：-[4]。近年来，鼠伤寒沙门菌单相株在世界范围内迅速流行、暴发，多重耐药不断加剧，引发了严重的公共卫生问题[5]。目前我国相关的报道较少，尚缺乏快速、有效的鉴定方法，故其流行情况、耐药谱等长期被忽视和低估[6]。本研究拟以上海市疾病预防控制中心细菌检测实验室收集的上海市流行的沙门菌为研究对象，应用血清分型和分子生物学技术，鉴定鼠伤寒沙门菌单相变异株，探讨其血清型、耐药谱型和基因型特征。

1 材料和方法

1.1 菌株和试剂

1.1.1 菌株 沙门菌由上海市疾病预防控制中心细菌检测实验室从腹泻患者粪便样本中分离并保存，鼠伤寒沙门菌标准株（ATCC 202165）由上海市疾病预防控制中心菌毒种保藏中心保存。

1.1.2 试剂和培养基 沙门菌显色培养基、水解酪蛋白胨培养基由上海市疾病预防控制中心培养基室配置。沙门菌诊断血清和诱导琼脂购自丹麦国家血清研究所。抗菌药物药物敏感性纸片和水解酪蛋白胨琼脂购自英国Oxoid公司，所有引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增试剂Premix taq、DL 2000 DNA marker购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 鼠伤寒沙门菌单相株鉴定

将2013—2015年上海市疾病预防控制中心细菌检测实验室收集的1 179株沙门菌进行复苏，分别进行PCR鉴定和血清分型。

1.2.1 PCR鉴定 采用煮沸裂解法获取沙门菌核酸，PCR扩增鼠伤寒沙门菌及其单相变异株共有的特异性基因片段fliB-fliA基因间区，引物序列见表1。PCR反应体系为： 2×Premix taq 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，模板DNA 1 μL，用无菌双蒸水补至25 μL。PCR反应条件见表1。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。扩增片段大小为964 bp的菌株是鼠伤寒沙门菌，扩增片段缺失或大小不符为其他血清型沙门菌。

表1 引物序列和PCR反应条件

1.2.2 血清分型 采用玻片凝集实验对菌株进行血清分型的复核，依据White-Kauffman-Le Minor抗原表，记录完整的抗原式，将血清型为4，5，12：i：1，2或者4，12：i：1，2的菌株记录为鼠伤寒沙门菌，对于连续诱导3次后仍然缺失Ⅱ相鞭毛抗原的鼠伤寒沙门菌，记录血清型为4，5，12：i：-或4，12：i：-。 血清型符合4，[5]，12：i：- 且fliB-fliA基因间区扩增片段大小为964 bp的菌株为鼠伤寒沙门菌单相株，统计分析2013—2015年上海市鼠伤寒沙门菌单相变异株的流行特征。

1.3 鼠伤寒沙门菌单相株基因特征研究

以鼠伤寒沙门菌单相株的核酸为模板，以鼠伤寒沙门菌标准株（ATCC 202165）为阳性对照，PCR扩增fljA、fljB和hin基因，引物序列见表1。PCR反应体系为： 2×Premix taq 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，模板DNA 1 μL，用无菌双蒸水补至25 μL，扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。见表1。

1.4 药物敏感性试验

药物敏感性试验采用世界卫生组织推荐的改良纸片扩散法，依据2016年美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）指南进行操作和结果判读。所选用的抗菌药物包括头孢西丁（cefoxitin，FOX）、头孢噻肟（cefotaxime，CTX）、头孢呋辛（cefuroxime，CXM）、庆大霉素（gentamicin，GN）、氨苄西林（ampicillin，AMP）、萘啶酸（nalidixic acid，NAL）、环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、左氧氟沙星（levofloxacin，LEV）、诺氟沙星（norfloxacin，NOR）、氯霉素（chloramphenicol，C）、四环素（tet racycli ne，TE）、链霉素（streptomycin，S）、磺胺异噁唑（sulfasoxazole，SF）和复方磺胺甲噁唑（sulfamethoxazoletrimethoprim，SXT）14种。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。耐药率比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2013—2015年上海市鼠伤寒沙门菌单相变异株检出情况

1 179株沙门菌中共分离出单相变异株52株，分别占所有沙门菌和鼠伤寒沙门菌的4.4%和23.3%。进一步分析这些单相变异株的宿主信息，发现31株（59.6%）单相变异株的宿主来源于15～60岁的青中年人群，9株（17.3%）来源于 0～15岁的少儿人群，12株（23.1%）来源于＞60岁的老年人群；宿主性别分析显示28株（53.8%）检出于男性，24株（46.2%）检出于女性；地域分布信息分析显示40株（76.9%）的宿主来源为上海郊区，12株（23.1%）的宿主来来源为上海市区。

2.2 鼠伤寒沙门菌单相株血清型特征和基因特征

血清分型结果显示52株鼠伤寒沙门菌单相变异株的血清型均为4，5，12：i：-，无4，12：i：-血清型。采用PCR检测52株单相变异株中fljB，fljA和hin基因的表达情况。通过统计发现，f l jB基因缺失株有44株，占84.6%。进一步检测fljB基因未缺失的8株单相变异株的fljA和hin基因后发现有2株fljA和hin基因同时缺失，另外6株均检测到f l jA和hin基因。

2.3 鼠伤寒沙门菌单相株对14种抗菌药物的敏感性

鼠伤寒沙门菌单相株中有3株对14种抗菌药物均敏感。有40株多重耐药，其中有36株（69.23%）耐4类以上抗菌药物，有13株（25%）耐6～7类抗菌药物。见图1。

图1 52株鼠伤寒沙门菌单相株对常用抗菌药物的耐药谱分析

从2013—2015年上海市疾病预防控制中心保存的沙门菌中每年分别随机抽取22株共66株鼠伤寒沙门菌双相株（4，[5]，12：i：1，2）作为对照，采用上述方法检测耐药谱。将2013—2015年的单相株与双相株的耐药结果进行比较，发现在单相株和双相株中分别有76.92%和48.48%的菌株耐3类以上抗菌药物。耐药谱中，双相株和单相株对AMP、SF、S、TE、NAL和C均表现出较高的耐药性，但单相株对氨苄西林-链霉素-磺胺类药-四环素（ampicillin-streptomycin-sulfonamidetetracycline，ASSuT）或青霉素-氯霉素-链霉素-磺胺类药-四环素（ampicillin-chloramphenicolstreptomycin-sulfonamide-tetracycline，ACSSuT）的耐药率远高于双相株（P＜0.05）。见表2。

表2 2013—2015年鼠伤寒沙门菌单相株和双相株耐药率比较 （%）

3 讨论

近十年来，国外文献报道鼠伤寒沙门菌单相变异株在动物和人群中快速传播，在引起感染的沙门菌血清型中比例大幅上升[7]，造成了多起食源性疾病的暴发[8]，同时，鼠伤寒沙门菌单相变异株也是引起医院交叉感染的重要致病菌之一[9]。在我国，关于鼠伤寒沙门菌单相变异株的报道较少。为获得上海市鼠伤寒沙门菌单相变异株的流行情况、表型及基因型和耐药谱等基础数据，本研究结合分子生物学技术和血清分型的方法，对2013—2015年上海市流行的沙门菌进行鉴定，结果显示，鼠伤寒沙门菌单相变异株在所有血清型沙门菌和鼠伤寒沙门菌中的构成比分别为4.4%和23.3%。这些病例主要以青中年人群为主，且主要分布在郊区，提示这可能与中青年人群的饮食习惯差于青少年及老年人群，郊区人群的卫生意识等弱于市区人群有关。

目前，关于我国鼠伤寒沙门菌单相变异株的报道较少的原因比较复杂，可能与传统血清分型方法受到诱导次数、诱导琼脂、诱导血清等多种因素的影响有关。另外，检测工作量大、工作时间长，对实验人员技术要求高导致记录不完整或命名混乱等也是原因之一。众多因素导致部分单相变异株漏检，影响到对该单相变异株的防控与治疗。本研究检出的52例鼠伤寒沙门菌单相变异株的血清型均为4，5，12：i：-，无4，12：i：-血清型。在鼠伤寒沙门菌中，有Ⅰ相和Ⅱ相鞭毛素编码基因分别位于染色体不同的部位，常以fliC和fljB分别表示。最初认为鼠伤寒沙门菌单相变异株是由fljB基因的缺失引起，在采用血清型方法进行鉴定时，由于存在上述多种因素的影响，欧洲食品安全局建议采用PCR扩增鼠伤寒沙门菌特异性片段fliB-fliA基因间区并以缺失fljB基因为标准来判定鼠伤寒沙门菌单相变异株[10]。但之后的研究发现部分鼠伤寒沙门菌单相变异株不缺失fljB基因。本研究结合传统的血清学鉴定方法和fliB-fliA基因间区PCR鉴定方法来检测鼠伤寒沙门菌单相变异株，共鉴定出52株单相变异株。进一步通过对鞭毛抗原编码基因的检测分析，发现有44株（84.6%）为fljB基因缺失型，与文献报道的部分鼠伤寒沙门菌单相变异株仍然含有完整的fljB基因结果相一致，提示在我国也存在fljB基因不缺失的鼠伤寒沙门单相株，因此不建议单纯依赖fljB基因检测来判定单相变异株。在Ⅱ相鞭毛素编码基因fljB的下游紧邻一个被称为fljA的特殊基因，与fljB构成同一基因簇fljBA，在fljBA的上游，存在一个编码重组酶的hin基因，影响f l jBA启动区域方向的正确性，如“开关”一样控制fljBA的表达[11]，fljA和hin等调控基因可能参与了鼠伤寒沙门菌单相突变的发生。本研究对8株fljB基因未缺失的单相变异株进行fljA和hin基因检测，其中有2株同时缺失fljA和hin基因，还有6株菌fljA和hin基因均未缺失，提示可能存在其他更复杂的调控机制引起Ⅱ相鞭毛素编码基因缺失[12]。

耐药率升高和多重耐药是鼠伤寒沙门菌单相变异株对人类健康的另一大威胁[13]。本研究结果显示鼠伤寒沙门菌单相变异株有着较高的耐药率，进一步的耐药谱分析结果显示上海地区的耐药谱与发达国家的耐药谱相似，以ASSuT四重耐药为典型，远高于鼠伤寒沙门菌双相株（P＜0.05），该数据也与我国关于食物中分离的鼠伤寒沙门菌单相变异株耐药特点相符[14]。本研究的结果同时显示多重耐药尤其是耐4类以上抗菌药物的鼠伤寒沙门菌单相株比例在ASSuT耐药的基础上，又增加了临床常见药物NAL和C等，这提示上海地区对单相变异株的防控形势更加严峻。这些多重耐药单相变异株的出现带来了较大的医疗负担和健康危害，同时鼠伤寒沙门菌单相变异株作为宽宿主范围血清型，可以广泛感染动物和人，对公共卫生安全造成较大危害。针对这些问题，上海市各级卫生机构应加强对鼠伤寒沙门菌单相变异株的监测，了解其耐药谱的变迁情况，为临床医生提供预防和治疗感染的合理方案，这具有非常重要的临床应用价值。

综上所述，通过对2013—2015年上海市鼠伤寒沙门菌单相变异株的分析，本研究获得了上海市鼠伤寒沙门菌单相变异株的流行背景信息、血清型和基因型特征，其地域分布及年龄分布结果提示在未来的疾病防控中应以郊区人群及青中年人群为重点防控对象。沙门菌监测人员要重视这类血清型，规范记录。单相变异株部分基因的缺失及表达，给进一步的机制研究提供了重要数据，并有助于研制有针对性的疫苗和治疗药物。在临床对抗菌药物的使用中，4类以上药物耐药菌是重点监测对象，本研究为临床用药提供了重要的参考。在以后的工作中，应每年针对鼠伤寒沙门菌单相变异株进行类似研究，关注其流行趋势，以有效防控。