乙醇脱氢核酶ribox02与NAD+/NADH结合位点的探测

李丹彬 张 静 陈东戎

(复旦大学生物医学研究院RNA生物学实验室 上海 200032 )

NAD+和NADH是细胞能量代谢所必需的辅酶[1]。细胞内氧化还原状态特别是 NAD+/NADH比值直接影响着细胞的节律、衰老、癌变和死亡。近年来,细胞内与NAD+和NADH相关的物质代谢研究倍受关注。

乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)能以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)为辅酶介导伯醇和醛之间的可逆反应。2003年,Tsukiji等[2]发现,具有与ADH相似催化功能的核酶ribox02与反应底物(苯甲醇/苯甲醛)之间的空间距离足够接近且在NAD+与Zn2+同时存在时ribox02能催化苯甲醇反应生成苯甲醛,同时NAD+被还原为NADH;之后又发现核酶ribox02能够在NADH和Zn2+同时存在时催化苯甲醇生成苯甲醛,而NADH被氧化生成NAD+,即ribox02 RNA 能以NAD+和NADH为辅酶催化苯甲醛与苯甲醇之间的可逆反应[3],且以NADH为辅酶生成醇的速度比以NAD+为辅酶催化生成醛的速度快[2-3]。研究人员通过观察突变后ribox02的活性变化来推测酶活性位点[2-4],间接验证法所得结果与mfold预测的结构相结合获得ribox02的二级结构。但该二级结构来自于间接推测,真实结果有待验证。通过突变实验获得ribox02全部活性的最小功能单位,去除66U～79G区域序列可使酶活性全部丧失,敲除L4序列也能大大降低酶活性,而去除或突变该RNA其他位点并未对酶活性产生明显影响,因此预测 ribox02 与辅酶小分子的结合位点可能位于GU序列较为丰富的J1/4区,而ribox02与NAD+和NADH的作用位点及结合机制尚不明确。

选择性2-OH酰基化学探测法(selective 2-hydroxyl acylation analyzed by primer extension,SHAPE)是基于FAM 引物引导的逆转录反应的RNA二级结构探测技术[5],非配对的核苷酸的 2’-OH 相比于配对的或其他限制性的核苷酸更容易受到亲核攻击,而NMIA 作为一种羟基选择性化学试剂能更迅速地与非配对的 RNA 核苷酸形成稳定的复合物。逆转录酶可在酰基复合物形成位点特异性终止延伸反应,从而产生特异性长度的 FAM-cDNA 荧光信号,而未经NMIA修饰的核苷酸位点FAM-cDNA的信号则处于本底水平。根据cDNA荧光信号的强度,可推测出 RNA各个核苷酸的配对情况,从而直接精确探测RNA的二级结构。

等温滴定量热法(isothermal titratio calorimetry,ITC)是通过检测样品池补偿功率的变化来拟合计算结合常数及结合热力学参数反应的热力学技术,在类似于化学滴定的过程中跟踪化学反应的热流随时间的变化[6-7],可用于检测NAD+、NADH与ribox02的特异性结合。

紫外交联技术(UV-crosslinking)的原理是基于紫外照射能激发核酸上的碱基,处于激发态的碱基能与数埃范围内含有不饱和双键的抗生素发生交联结合,且这种结合是不可逆的共价交联[8],通过带FAM荧光引物引导的逆转录反应可得到抗生素结合在RNA上的位置信息,从而精准定位NAD+、NADH与核酶ribox02的特异性结合位点。

本研究旨在揭示核酶ribox02与NAD+、NADH特异性结合的位点及其结合力性质,以期为核酶ribox02的应用提供一定的理论基础。

资 料 和 方 法

质粒和菌株质粒pGEx-4T-1由本实验室构建,大肠埃希菌JM109购于上海生工生物工程有限公司。

试剂氨苄青霉素;LB培养基;LB固体培养基;1%胰蛋白酶;0.5%酵母提取液;1%氯化钠;1.5%和1%琼脂糖凝胶;1 mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(pH=8.0);0.5 mol/L乙二胺四乙酸;3 mol/L醋酸钠;1 mol/L 二硫苏糖醇;5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷;40%(w/v)丙烯酰胺;5×体外转录缓冲液;200 mmol/L 3-羟甲基氨基甲烷盐酸盐;0.1%(v/v)聚乙二醇辛基苯基;100 mmol/L氯化镁;10 mmol/L亚精胺;5×TBE电泳缓冲液(pH=8.3):500 mmol/L 3-羟甲基氨基甲烷,400 mmol/L H3BO3,10 mmol/L乙二胺四乙酸;EK 缓冲液(pH=8.0):50 mmol/L 4-羟乙基哌嗪丙磺酸,500 mmol/L 氯化钾,100 mmol/L氯化镁,0.5 mmol/L氯化锌。

分子克隆ribox02 RNA 序列:3’-GGG-AUCGUCAGUGCAUUGAGAUGUUUCUCAGA-CUGAUUAUCGUGAGACAGUGAUCUCGUGG-UCAGUCCUAGUUUGGGGGCUGGUCCUCACG-GUGGUAUCCCCAAGGGGUA-5’;ribox02-linke RNA序列:3’-GGGAUCGUCAGUGCAUUGAG-AUGUUUCUCAGACUGAUUAUCGUGAGACA-GUGAUCUCGUGGUCAGUCCUAGUUUGGGG-GCUGGUCCUCACGGUGGUAUCCCCAAGGGG-UAUCGAUCCGGUUCGCCGGAUCCAAAUCGG-GCUUCGGUCCGGUUC-5’。

ribox02是经过随机组合筛选出来的RNA序列,无模板,故通过引物退火延伸获得该序列,ribox02的DNA序列加上保护碱基,酶切位点以及T7序列后所得序列如下:3’-CTAGTCTAGATA-ATACGACTCACTATAGGGGGGATCGTCAGT-GCATTGAGATGTTTCTCAGACTGATTATCG-TGAGACAGTGATCTCGTGGTCAGTCCTAGT-TTGGGGGCTGGTCCTCACGGTGGTATCCCCA-AGGGGTAGGATCCGCG-5’ (保护碱基+XbaⅠ+T7 seq+ribox02 seq+BamHⅠ+保护碱基)。

将待研究序列放入Helix Systems的DNA Works中,得到合成ribox02序列所需的寡核苷酸片段:Oligos 1:3’-CTAGTCTAGATAATACGACTCA-CTATAGG-5’;Oligos 2:3’-CAATGCACTGAC-GATCCCCCCTATAGTGAGTCGTATTATCTAG-ACT-5’;Oligos 3:3’-GGGGATCGTCAGTGCA-TTGAGATGTTTCTCAGACTGATTATCG-5’;Oligos 4:3’-AGGACTGACCACGAGATCACT-GTCTCACGATAATCAGTCTGAGAAACATCT-5’;Oligos 5:3’-TGATCTCGTGGTCAGTCCTA-GTTTGGGGGCTGGTCCTCACGGTGGTATCCC-CA-5’;Oligos 6:3’-CGCGGATCCTACCCCTTG-GGGATACCACCGTGA-5’。

退火延伸得到的DNA片段与载体质粒pGEx-4T-1中加入内切酶XbaⅠ和BamHⅠ,37 ℃反应1.5 h。分别加入4 μL 10×上样缓冲液,将酶切产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分离,割胶回收;0.3 pmol DNA片段与0.03 pmol载体在T4 DNA 连接酶作用下进行连接,连接产物转化到感受态大肠埃希菌JM109中,涂板,37 ℃培养过夜,第2天挑取单菌落测序,测序正确的单克隆菌株体内所含质粒即可作为体外转录RNA的DNA模板。

体外转录设计含有T7RNA聚合酶启动子的引物以及带有连接片段linker的引物,通过PCR扩增获得转录模板。PCR体系:2 μL ribox02上游引物,2 μL linker下游引物,0.5 μL质粒模板,25 μL 2×Phanta SF反应缓冲液,4 μL dNTP混合物,1 μL Phanta聚合酶,18.5 μL H2O。反应过程:95 ℃变性10 s,56 ℃退火15 s,72 ℃延伸45 s,30个循环,72 ℃延伸10 min。乙醇沉淀PCR产物,适量水溶解PCR产物作为转录体系的模板。500 μL转录体系:50 μL 10×转录缓冲液,5 μL二硫苏糖醇(1 mol/L),112.5 μL rNTP混合物(25 mmol/L),25 μL DNA 模板(700 ng/μL),12.5 μL RNA核酶抑制剂,50 μL T7 RNA 聚合酶,245 μL超纯水。37 ℃反应过夜,加1 μL脱氧核酶Ⅰ(500 U/μL),37 ℃反应1 h;加入等体积甲酰胺(含溴酚蓝和二甲苯氰),95 ℃变性5 min,冰上保存待用。

SHAPE和紫外交联实验结果都通过逆转录引物延伸反应来展示,而引物延伸会使RNA的5’端的引物结合部位信息缺失,因此SHAPE和紫外交联实验所用的ribox02-linker RNA与ITC实验所用的ribox02 RNA不一样,ribox02-linker RNA的下游引物前面加上一段不会影响RNA折叠的linker 序列。ribox02上游引物:3’-TAATACGA-CTCACTATAGGGGGGA-5’;ribox02下游引物:3’-TACCCCTTGGG-GATACCACCG-5’;ribox02-linker下游引物:3’-GAACCGGACCGAAGCCC-GATTTGGATCCGGCGAACCGGATCGATACC-CCTTGGGGATACCACCGTGAGG-5’。ribox02上游引物作为通用引物,可用于2种RNA的合成体外转录体系中。ribox02上游引物与ribox02下游引物作为一对引物,合成的ribox02为后续ITC实验所用;ribox02上游引物与ribox02-linker下游引物作为一对引物,合成的ribox02-linker为后续SHAPE实验及紫外交联实验所用。

纯化RNA配置12%的变性聚丙烯酰胺凝胶,电压1 200 V,功率70 W,预电泳30 min直至玻璃胶板高于50 ℃,上样,电泳6 h;脱胶置于保鲜膜上,以荧光板为背景,暗室操作,紫外灯照射发光,254 nm下核酸条带呈黑色;切下条带,切碎后放入50 mL康宁管中,加入约20 mL含醋酸钠(0.3 mol/L,pH=5.2)和EDTA(1 mmol/L,pH=8.0)的透析缓冲液,4 ℃震荡4 h,析出RNA;取溶液,用0.22 μm滤膜过滤除去聚丙烯酰胺胶颗粒,剩余胶带进行第2次透析;透析后的溶液用乙醇沉淀,加入1/10体积的醋酸钠(3 mol/L,pH=5.2)和2.5倍体积的无水乙醇,-80 ℃放置30 min,4 ℃下9 000×g离心15 min,弃上清;加入600 μL预冷的75%乙醇,4 ℃下9 000×g离心5 min,弃上清(重复上述步骤),室温晾干制成RNA干粉,-80 ℃保存备用。

SHAPE法用EK缓冲液溶解RNA干粉,根据260 nm处的吸光度(D)值来配置10 pmol/μL的ribox02-linker RNA,取1 μL RNA(10 pmol/μL)加入去核糖核酸酶的EP管中,加入17 μL EK缓冲液;4 ℃离心30 s,使溶液到达1.5 mL EP管底部,95 ℃变性5 min,自然冷却至室温,加入1 μL NMIA,37 ℃反应1 h;75%乙醇洗2次,晾干后用于后续逆转录。沉淀RNA中依次加入8 μL miliQ-H2O,2 μL特定的引物(10 μmol/L),5×逆转录缓冲液(4 μL),RNA marker反应体系还需加2 μL ddNTP (10 mmol/L),4 ℃离心30 s,65 ℃加热5 min,取出后置于冰上,4 ℃离心30 s,EP管内加入1 μL二硫苏糖醇(0.1 mol/L)、0.5 μL逆转录酶Ⅲ、0.5 μL核酶抑制剂(40 U/μL),混匀,55 ℃反应1 h;加入1 μL NaOH(4 mol/L),95 ℃变性5 min,冰上快速冷却,乙醇沉淀。用19 μL H2O溶解RNA沉淀,取1 μL用于ABI自动测序仪3730进行测序,采用Peak Scanner软件V1.0分析结果。

ITC法配制合适浓度的小分子和RNA:电子天平称取NAD+和NADH各0.066 g分别溶于1 mL的EK缓冲液中,配制成母液(100 mmol/L),根据实验需要进行稀释。500 μL 转录体系获得的干粉 RNA 用 500 μL EK缓冲液溶解,根据 RNA 在260 nm处的D值计算 RNA 浓度,根据实验需要用EK缓冲液进行稀释,稀释后的RNA在95 ℃变性5 min,退火复性。小分子和RNA在4 ℃下9 000×g离心1 min,去气泡。至少设置另外3个空白滴定实验:配体滴缓冲液、缓冲液滴大分子溶液和缓冲液滴缓冲液。取60 μL样品加入0.2 mL离心管中进行滴定实验,加样时应避免产生气泡,设置样品池温度为25 ℃,间隔时间为120 s,滴定针数为20,实验完成后采用Origin 7.0处理数据。

紫外交联技术根据260 nm处的D值来配置10 pmol/μL RNA,取1 μL RNA于去核糖核酸酶的EP管中,加入EK缓冲液(去镁离子),使体积达到18 μL;短暂离心,使溶液到达1.5 mL EP管底部,95 ℃加热5 min,无干扰退火至室温,加入1 μL MgCl2(2 mmol/L),25 ℃反应30 min;加入1 μL各浓度梯度的NAD+和NADH,25 ℃反应30 min;在冰盒中打开EP管,254 nm紫外光下照射5 min;反应结束后用75%乙醇洗2次,晾干,沉淀RNA用于后续逆转录。逆转录与SAHPE逆转录操作步骤相同。

结 果

ribox02RNA二级结构的探测在ribox02序列的SHAPE实验结果中,未经NMIA修饰与经过NMIA修饰的RNA所产生的二级结构信号明显不同。未经修饰的RNA经逆转录后在各个核苷酸位点不呈现FAM-cDNA的荧光信号差异,图1A中红色测序信号为ribox02 RNA经过NMIA修饰后的逆转录信号,黑色测序信号(作为对照样本)为RNA未经化学试剂修饰所产生的信号图,可见红色测序信号有7个信号明显较高的区域,即非配对单链区域。我们根据SHAPE数据结果绘测出ribox02 RNA的二级结构(图1B)。

NAD+、NADH与ribox02RNA的相互作用因NADP+和NADPH的化学性质、吸收光谱、氧化还原形式等均与NAD+和NADH相似,故选取NADP+和NADPH作为阴性对照(实验结果未公布)。一定浓度的NAD+和NADH分别滴定ribox02,数据经Origin 7.0软件处理。由ITC反应中补偿功率随时间变化的曲线图以及反应热随摩尔比变化的曲线图中可看出,NADH能与ribox02 RNA进行迅速而有效的特异性结合(图2A),平衡解离常数高达2.92×107±8.35×106(表1),而NAD+(图2B)与NADH相比,呈现出较弱的亲和力。由此可见,NADH与ribox02能更快、更有效地识别结合并催化反应。

对ITC原始数据反应热函数用One Set of Sites模型进行拟合,这些结合参数包括结合反应的结合常数、焓变、熵变和化学计量比。此外,根据Ross等[9]的热力学规律:ΔH0≥0且ΔS0>0,为疏水作用力;ΔH0<0且ΔS0>0,为静电作用力;ΔH0<0且ΔS0<0,为范德华力或氢键作用,可以推断NAD+、NADH与ribox02 RNA结合的作用力都为范德华力或氢键作用。

图1 ribox02 RNA的SHAPE实验结果(A)及其二级结构预测(B)Fig 1 SHAPE result of ribox02 RNA (A) and its secondary structure probed by SHAPE (B)

MicromoleculeKd (/mol)ΔH (cal/mol)ΔS(cal/deg) NADH2.92×107± 8.35×106-2.05×104±274.2-36.4NAD+9.15×103±2.18×104-1.472×104±1.681×104-32.4

The upper curver showed compensation power changed with time in isthermal titration reaction,and the lower curver showed reaction heart changed with molar ratio.A:160 μmol/L NADH titraced 16 μmol/L ribox02 RNA;B:400 μmol/L NAD+tritraced 40 μmol/L ribox02 RNA.Reaction condition:25 ℃,a total of 20 needle,2 μL/needle,intervel of 120 s.

图2ITC所得数据经Origin7.0处理后的曲线图
Fig2GraphofITCdateprocessedbyOrigin7.0

紫外交联技术探测NAD+、NADH与ribox02RNA的特异性结合位点ribox02 RNA分别与NADH、NAD+、NADP+和NADPH进行紫外交联(图3),逆转录后测序得到信号峰;其中蓝色信号为 RNA 自我交联的背景值,红色信号为 RNA 与小分子交联产生的信号峰。由图3A、3B可见23G～25U、38U、72U～75G和95G这9个位点的信号值在加入小分子NAD+、NADH后均有明显上升,这说明NAD+、NADH与RNA在上述位点结合并被交联,对于NADP+、NADPH 并未检测到交联位点,这与ITC的实验结果相一致。对比图3A和图3B,NADH所引起的信明号的改变比NAD+所引起的信号改变更为明显,这也从侧面验证了ITC实验所预测的结论,即相较于NAD+,NADH与ribox02能更快速而有效地识别结合并催化反应。在RNA二级结构上NAD+、NADH与ribox02的紫外交联位点如图4所示。

Blue signal:Background of RNA self crosslinking;Red signal:RNA crosslinking with the small molecules.

图3ribox02RNA与NADH、NAD+、NADPH和NADP+的紫外交联实验结果
Fig3Theresultofribox02RNAcrosslinkedwithNADH,NAD+,NADPHandNADP+

图4NAD+/NADH与ribox02的紫外交联位点在RNA二级结构上的图示
Fig4UV-crosslinkingbindingsitesofNAD+/NADHonthesecondarystructureofribox02RNA

讨 论

ITC实验结果证实小分子NADH和NAD+能与ribox02 RNA结合,即在空间位置上小分子能够与ribox02 RNA处于无限靠近的距离,而NADH、NAD+、NADP+和NADPH分子结构上都含有不饱和双键,紫外交联反应能够使得小分子不可逆地以共价键的形式交联在RNA上,经交联的RNA通过FAM荧光引物引导逆转录反应,在交联位点逆转录会终止,通过测序可知交联位点就是NAD+、NADH与ribox02 RNA的结合位点。结合紫外交联数据和SHPEA所探测到的ribox02 RNA二级结构(图4)分析发现:(1)小分子与RNA的9个结合位点23G、24U、25U、38U、72U、73U、74U、75G和95G均为G/U,并未出现A/C,这是因为NAD+和NADH分子内含有腺嘌呤残基,根据摇摆碱基对原则,NAD+和NADH更容易与G、U结合。(2)所有的结合位点均位于RNA的颈环结构,这是因为颈环结构的碱基在空间上更有利于与小分子进行结合。(3) L2区域中的72U～75G位点是NAD+、NADH的主要结合位点之一,这一结果也解释了P4/L2区域之所以能够显著影响ribox02的酶活性,但主要结合位点并非位于Tsukiji等[2]预测的J1/4,而是位于L2区域72U～75G。(4) 这9个结合位点都存在于最小功能单位compact ribox02里,因此compact ribox02具有核酶ribox02的所有功能。(5)38U和95G是NAD+和NADH的重要结合位点。Tsukiji等[2]发现突变38U～40U和92G～94G对ribox02酶活性的影响很大,解释为38U～40U和92G～94G应处于配对状态,但这一推测并不严谨,结合SHAPE的结果,我们发现38U～40U和92G～94G处于非配对状态,而该区域之所以能影响ribox02的活性,是因为38U与95G是NAD+和NADH的重要结合位点。(6) 辅酶小分子NAD+、NADH与RNA的结合位点主要分布在二级结构上,并不十分靠近L1、L2和J1这3个区域。这是因为任何RNA尤其是功能性RNA,在溶液中的结构绝不止二级结构这样简单,RNA会折叠为复杂的三维结构形式以行使其生物学功能。由小分子与RNA的结合位点可以推测,P4和L2借助J3面向L1弯曲折叠,与J1部位形成了一个三维空间“口袋”,从而为NADH和NAD+的特异性结合提供了空间可能性。

核酶可特异性与靶分子mRNA结合并促进mRNA裂解,且裂解完毕后自行脱离,再与其他靶分子RNA结合,因此可在不影响宿主细胞RNA的条件下,特异性结合并切割病毒RNA。利用核苷酸序列特异的酶切活性不仅可以研究特定基因的功能,也可利用此特点来寻找疾病治疗的新靶标。鉴于核酶具有分子结构简单、分子量小和易于合成并设计的优点,可望开发出具有治疗作用的核酶制剂。目前已有不少核酶已经进入临床试验阶段(如肿瘤治疗和AIDS治疗等)。