促离子型谷氨酸受体在正常大鼠下丘脑视前区的表达*

谢爽 孙燕泥 徐润 唐雅雪 袁平 夏欢 杨明 杨铠瑞 唐瑜

(1.合江县人民医院检验科，四川 合江 646200；2.成都医学院检验医学院； 3.成都医学院临床医学院；4.成都医学院生理学教研室，四川 成都 610500)

下丘脑视前区(Preoptic area，POA)是维持哺乳动物体温恒定的重要中枢调节部位，视前区分布的温度敏感神经元通过控制皮肤血管收缩、棕色脂肪组织产热和战栗产热，参与体温调节活动[1-3]。研究发现下丘脑存在局部的谷氨酸能神经环路[2,4,5]，谷氨酸作为中枢神经系统一种重要的兴奋性神经递质参与了体温调节[6-8]。促离子型谷氨酸受体属于配体门控离子通道，广泛分布在神经元突触后膜，介导快兴奋性突触传递，主要包括N-甲基-D-门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate receptors，NMDARs)受体和α-氨基-3-羟基-5-甲基异恶唑-4-丙酸(alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptors, AMPARs)受体。NMDA受体包括NR1、NR2和NR3三个亚基，分别由GRIN1、GRIN2A-D和GRIN3A-B基因负责编码；作为一种异四聚体，一般由两个NR1亚基和两个NR2亚基组成，较少含有NR3亚基，其中NR1亚基作为NMDA受体的功能亚单位，对于维持NMDA受体的功能非常重要[9,10]。AMPA受体也是一种同/异四聚体，由GluR1-4四个亚基组成，其中GluR2亚基存在mRNA Q/R位点编辑，带正电的R(精氨酸)取代Q(谷氨酰胺)，使AMPA受体对钙离子具有较低的通透性，所以GluR2亚基在AMPA受体中的相对表达决定AMPA受体的功能特性[11,12]。整体动物实验发现，激活视前区中枢AMPA受体可以升高体温[13]，而阻断中枢谷氨酸促离子型受体，可以抑制外周注射精氨酸加压素引起的低温反应[14]。电生理实验在大鼠视前区温度敏感神经元上记录到了兴奋性突触活动[15]，抑制这些突触传递，可以影响视前区温度敏感神经元的放电和温度敏感性，从而调节体温[16,17]。但是这些介导视前区神经元兴奋性突触传递的促离子型谷氨酸受体亚基尚不清楚。本实验采用逆转录实时荧光定量PCR和Western blot技术鉴定成年SD大鼠视前区表达的促离子型谷氨酸受体亚基，为后续研究促离子型谷氨酸受体及其亚基在视前区神经元温度敏感性形成机制和体温调节中的作用奠定分子基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

1.1.2 主要试剂与抗体

RNAlater、Trizol由美国Invitrogen公司生产；DEPC为美国Sigma公司产品；PrimeScript RT reagent Kit、FastStart Essential Probes Master分别购自大连宝生物工程有限公司和Roche公司；RIPA裂解液、TEMED、PMSF为碧云天公司产品；BCA蛋白含量检测试剂盒购于南京凯基公司；4 × loading buffer、蛋白Marker为美国Bio-Rad公司产品；ECL化学发光试剂盒购于Millipore公司；氯仿、异丙醇、甘氨酸、过硫酸铵、氯化钠、戊巴比妥钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾，等均购自成都科龙化工试剂有限公司。兔抗鼠一抗GluR1(13185)、GluR2(5306)、GluR3(4676)购自美国CST公司；NR2A(AGC-002)、NR2B(AGC-003)为以色列Alomone公司产品；NR1(ab109182)、β-actin(ab8227)和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(ab6721)为Abcam公司产品。

1.1.3 主要实验仪器与设备

荧光定量PCR仪(CFX Manager，美国Bio-Rad公司)、高速冷冻离心机(美国Thermo公司)、微量分光光度计(美国Thermo公司)、凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)、纯水系统(成都超纯科技有限公司)、电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)、干式恒温微量恒温器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)、酶标仪(美国Biotek公司)、振动切片机(德国徕卡公司)。

1.1.4 探针与引物

荧光定量PCR检测目的基因所使用的探针选自瑞士Roche公司探针库(UPL Probes)，所需引物为该探针库所匹配设计的特异引物(表1)。探针成品购自Roche公司，引物由成都梓熙擎科生物技术公司合成。

表1 目的基因探针及引物序列

1.2 方法

1.2.1 取材

腹腔注射4%戊巴比妥钠(1 ml·Kg-1)麻醉大鼠，开颅取脑后在0.1% DEPC处理过的冰PBS液中修块，制备含有视前区的脑组织。用振动切片机切成300 μm厚的下丘脑片，在解剖显微镜下剥离视前区组织，迅速置于装有1 ml RNAlater的EP管中。4℃过夜，-20℃保存备用。

1.2.2 逆转录实时荧光定量PCR

1.2.2.1 总RNA提取

将保存于RNAlater的组织块用无酶镊子转移至1 ml Trizol中，严格参照Trizol试剂说明书操作，获得总RNA并溶解于15 μl无RNA酶水中，使用紫外分光光度计测定RNA浓度及纯度，A260/280=1.8～2.0。1%甲醛变性琼脂糖凝胶上进行电泳检测RNA完整性，可见明亮的28S、18S及5S 3条带，无DNA污染条带。

1.2.2.2 cDNA合成

首先去基因组DNA，反应体系为：5×gDNA Eraser Buffer 2 μl，gDNA Eraser 1 μl，总RNA 2 μg，加无酶水至总体系为10 μl，混匀离心后转至PCR仪，42℃孵育2 min；然后在体系内加入10 μl的逆转录预混液，该预混液含：PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μl，RT Primer Mix 4 μl，5×PrimeScript Buffer24 μl，RNase Free dH2O 1 μl。混匀离心后在PCR仪内反应：37℃ 15 min，85℃ 5 sec。

1.2.2.3 荧光定量PCR检测目的基因mRNA表达

10 μl反应体系：FastStart Essential Probes Master 5 μl，引物及探针各0.15 μl，2 μl cDNA，加无酶水定容为10 μl。扩增程序：95℃预变性10 min；然后95℃10 sec，60℃30 sec，读取荧光值，循环45次；最后40℃延伸30 sec。分别检测目的基因和β-actin mRNA的临界循环数(threshold cycle，Ct)，每个样品均作复孔。以β-actin为内参，使用相对定量法计算各样本ΔCt(目的基因Ct值-内参基因Ct值)，表示目的基因mRNA相对表达。ΔCt值越低，说明mRNA的量越多。

1.2.3 Western blot

组织块按1 g：5 ml加入裂解液(RIPA：PMSF=100：1)，电动匀浆后置于冰上裂解30 min，随后4 ℃ 13000 g 10 min离心，取上清至新的预冷的EP管中。严格按照BCA试剂说明书进行蛋白定量，以100 μg为标准分装样品，加入5 μl 4×loading buffer，定容为20 μl，涡旋震荡混匀，100℃恒温加热10 min。将样品进行SDS-PAGE，使用4℃过夜的10%凝胶，电泳100 V 20 min，120 V 80 min；根据蛋白Marker指示，切下相应范围的胶条，转膜，4℃ 200 mA 90 min。5%脱脂奶粉37℃封闭5 min，一抗(兔抗鼠)4 ℃震荡过夜(NR2A、NR2B、NR1、GluR1、GluR2、GluR3 1：400，β-actin 1：5000)，TBST洗膜3次，10 min/次，二抗(1：5000)37℃震荡2 h，TBST洗膜3次，10 min/次。用凝胶成像分析系统分析结果，计算条带的积分光密度值(IOD)。实验结果以目的蛋白相对表达量(目的蛋白IOD/内参IOD)表示。

1.3 数据处理

本文所有数据均以Mean±SE表示，用SPSS 17.0软件进行统计分析。采用One-Way ANOVA检验比较样本间均数，方差齐则采用Dunnet t检验，方差不齐则采用Tamhane′s T2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠视前区NMDA受体和AMPA受体亚基mRNA的表达

如表2所示，视前区存在NMDA受体亚基Nr2a、Nr2b和Nr1 mRNA的表达，同时AMPA受体亚基表达Glur1、Glur2和Glur3 mRNA，但没有检测到Glur4。与Nr1 mRNA相比，Nr2a(P<0.01)、Glur1(P<0.05)和Glur3(P<0.05)的mRNA表达显著降低，而Nr2b和Nr1 mRNA的表达无统计学差异(P>0.05，表2)。与Glur2 mRNA相比，Nr2a(P<0.01)、Nr2b(P<0.05)、Glur1(P<0.01)和Glur3(P<0.01)mRNA的表达减少，且有统计学意义，但是Glur1和Glur3 mRNA的表达无统计学差异(P>0.05)。这些结果说明大鼠视前区NMDA受体亚基主要表达Nr2b和Nr1 mRNA，AMPA受体亚基表达mRNA以Glur1、Glur2、Glur3主，且Glur2表达最高。

2.2 大鼠视前区NMDA受体和AMPA受体亚基蛋白的表达

如图1A所示，视前区存在NMDA受体亚基NR2A、NR2B、NR1和AMPA受体亚基GluR1、GluR2、GluR3蛋白表达。NMDA受体亚基蛋白NR2A与NR1相比表达明显较少(P<0.05)；NR2B表达虽然较高，但和NR1蛋白表达比无统计学差异(P>0.05，图1B)。AMPA受体亚基GluR1和GluR3蛋白相对表达高于GluR2，但只有GluR3的表达差异有统计学意义(P<0.05)。同时GluR1、GluR2、GluR3和NMDA受体亚基蛋白NR1的表达相当(P>0.05)，而NMDA受体亚基蛋白NR2A明显低于AMPA受体亚基蛋白GluR2(P<0.01)，NR2B的表达正好相反(P>0.05)。这些结果说明大鼠视前区NMDA受体亚基主要表达NR2B和NR1蛋白，AMPA受体亚基蛋白主要表达GluR1、GluR2、GluR3，且GluR3表达最高。

图1 大鼠视前区NMDA受体和AMPA受体亚基蛋白表达A：Western blot检测大鼠视前区NMDA受体亚基(NR2A、NR2B、NR1)和AMPA受体亚基(GluR1、GluR2、GluR3)表达的代表蛋白条带，β-actin为内参蛋白；B：NMDA受体亚基(NR2A、NR2B、NR1)和AMPA受体亚基(GluR1、GluR2、GluR3)蛋白相对表达量(目的蛋白/β-actin)。与NR1亚基蛋白相比，*P<0.05；与GluR2亚基蛋白相比，△P<0.05，△△P<0.01，n=6。1，2分别代表1号和2号大鼠。

目的基因Ct目的基因β-actin△CtNMDA受体Nr2a亚基31.51±0.3115.22±0.0816.40±0.31**△△NMDA受体Nr2b亚基23.32±0.0415.22±0.088.20±0.04△NMDA受体Nr1亚基22.98±0.4615.22±0.087.87±0.46AMPA受体Glur1亚基24.78±0.5115.22±0.089.67±0.51*△△AMPA受体Glur2亚基22.72±0.1915.22±0.087.61±0.19AMPA受体Glur3亚基25.09±0.4415.22±0.089.98±0.44**△△

与Nr1亚基mRNA相比较，*P<0.05，**P<0.01；与Glur2亚基mRNA相比较，△P<0.05，△△P<0.01。

3 讨论

下丘脑视前区参与体温调节[1-3,18-20]，分布的温度敏感神经元既可以感受局部温度变化，又可以接受外周传入的温度信号，故其放电活动受到突触传递的调制作用[20,21]。视前区温度敏感神经元可以控制机体的产热(冷敏神经元兴奋)和散热(热敏神经元兴奋)活动，这提示突触传入可以通过影响视前区温度敏感神经元的放电调节体温。研究发现皮肤温度信号上传到下丘脑正中视前核的谷氨酸能中间神经元，然后传入到内侧视前区，视前区热敏神经元接受正中视前核的谷氨酸能突触传入后，调制视前区热敏神经元的放电活动[2-5]。这说明影响视前区温度敏感神经元活动的突触传递可能与激活谷氨酸受体有关。整体动物实验发现，阻断中枢促离子型谷氨酸受体而不是促代谢型受体后，大鼠腹腔注射精氨酸加压素引起的低温反应消失[14]，而直接激活视前区AMPA受体可明显升高动物体温[13]。

中枢主要的谷氨酸促离子型受体包括NMDA受体和AMPA受体，广泛分布在许多类型的神经元上，尤其是突触后膜。作为典型的配体门控离子通道，介导兴奋性的快突触传递活动，在调节神经元的放电频率，放电模式，参与形成学习与记忆等方面均有重要作用。哺乳动物神经元上NMDA受体存在NR1、NR2和NR3三个亚基，作为一种异四聚体，一般由两个NR1亚基和两个NR2A-D亚基组成，较少含有NR3亚基，其中NR1亚基作为NMDA受体的功能亚单位，对于维持NMDA受体的功能非常重要[9,10]。AMPA受体是由GluR1-4四个亚基组成的同/异四聚体，其中GluR2亚基决定AMPA受体对钙离子具有较低的通透性，它的相对表达决定AMPA受体的功能特性[11,12]。所以，在本实验中我们将NR1、GluR2 mRNA和蛋白表达分别作为对照进行比较，并且用这两亚基的表达分别代表NMDA受体和AMPA受体的功能。

采用qRT-PCR技术，在所有6只大鼠视前区都检测到了Nr2a、Nr2b、Nr1、Glur1、Glur2和Glur3 mRNA，但没有检测到Glur4 mRNA。这也和文献报道相一致，含有GluR4亚基的AMPA受体通常表达在大鼠幼年期，而在成年大鼠主要表达由GluR1、GluR2、GluR3组成的AMPA受体[9,10]。相对定量显示，在视前区Nr2amRNA表达明显低于Nr1，而Nr2b和Nr1 mRNA表达基本相当；Glur1、Glur3 mRNA表达也明显低于Glur2。采用Western blot技术，在所有6只大鼠视前区都检测到了NR2A、NR2B、NR1、GluR1、GluR2和GluR3亚基蛋白表达。相对定量结果显示，视前区NMDA受体亚基蛋白表达趋势与mRNA相一致，NR2A明显低于NR1，NR2B和NR1表达基本相当。这说明视前区NMDA受体的构成以NR1/NR2B为主，而不是NR1/NR2A。这不同于以往的报道[15]，成年大鼠皮层、海马以NR2A表达为主，且突触上的NR2B蛋白表达具有年龄依赖性，海马CA1、CA3区NR2B蛋白在出生时达到最高峰，7天后逐渐降低。海马NR2B蛋白表达的变化与突触可塑性密切相关，参与了长时程增强的形成[16]。NR2B亚基mRNA表达的变化可能引起脑缺血再灌注后细胞的凋亡[17]。但在视前区NMDA受体构成以NR1/NR2B为主有何生理意义，其如何参与体温调节活动，还有待于进一步研究证实。有趣的是视前区AMPA受体亚基蛋白表达与mRNA并不一致，GluR1和GluR2表达水平相当，GluR3表达高于GluR2。这有可能与GluR3蛋白表达升高后，通过负反馈调节抑制其mRNA表达有关。一般在动物神经元上GluR2亚基高表达，这决定了AMPA受体对钙离子较低的通透性[12]，从而保护神经元避免钙超载的发生。本实验中，无论是mRNA还是蛋白表达，NR1和GluR2均无统计学差异，而NR1是NMDA受体的功能亚基[9,10]，这提示在视前区NMDA受体和AMPA受体从表达上来看，其功能作用大体相当。

综上所述，本实验从基因转录和蛋白质水平证实，在正常大鼠视前区存在促离子型NMDA受体和AMPA受体的表达，其主要亚基分别为NR1/NR2B、GluR1-3，但从受体功能上看两种促离子型谷氨酸受体表达没有差异。这将为后续研究促离子型谷氨酸受体及其亚基在视前区神经元温度敏感性形成机制和体温调节中的作用提供实验依据。