血清miR-34 c和miR-127-3p表达在结肠癌诊治中的临床意义

周联明，张学利，杨 治，檀占海，孙家亮，朱光辉

(上海交通大学附属第六人民医院南院/上海市奉贤区中心医院，上海 201499)

结肠癌是常见的胃肠道肿瘤，发病率呈逐年上升的趋势，其发生发展是多基因和多步骤的过程。由于结肠癌位于腹腔中，内镜和影像学检查为主，操作复杂，早期诊断较为困难。因此寻找早期发现和诊断，并明确其生物特性尤其重要。微小RNA(miRNA)是一类非编码的小分子RNA，在基因转录水平对人体关键的生理过程具有一定的调控作用[1]。最新的研究表明miRNA具有类似癌基因和抑癌基因的作用，对结肠癌的侵袭和转移具有重要作用[2]。miR-34 c类似抑癌基因，其高表达对机体的有保护作用，在肿瘤发生发展过程中具有重要作用[3]；另一个基因miR-127-3p类似癌基因，在肿瘤的复发和转移过程中具有重要作用[4]。目前，联合检测miR-34 c和miR-127-3p基因在结肠癌中表达尚未见文献报道，本研究通过联合检测结肠癌患者血清miR-34 c和miR-127-3p的表达水平，旨在观察其与临床病理因素的关系，现将结果报道如下。

1 临床资料

1.1一般资料 本研究方案经医院伦理委员会审核通过。选择2012年1月—2015年12月在我院就诊行手术治疗的结肠癌患者183例，结肠腺瘤患者60例，分别纳入结肠癌组和结肠良性肿瘤组。患者均经病理证实，术前无放疗、化疗和全身治疗；所有患者对研究知情同意。排除其他恶性肿瘤患者，血液系统疾病和免疫系统疾病者，不愿意参加本研究的患者。结肠癌组男104例，女79例；年龄35～70(54.68±11.35)岁；肿瘤浸润深度侵及浆膜层95例，未及浆膜层88例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期61例，Ⅲ～Ⅳ期122例；淋巴结转移阳性54例，阴性129例。结肠良性肿瘤组男35例，女25例；年龄35～70(54.68±9.67)岁。选择同期在我院行健康体检者30例为健康对照组，男17例，女13例；年龄35～70(53.98±11.65)岁。各组年龄和性别等一般资料差异无统计学意义(P均>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1血液标本的抽取 患者入院时和手术15 d后空腹取肘静脉血，将标本分别装于干燥试管中4 mL。干燥试管中的血液标本予以室温下静置1 h，以3 000 r/min离心5 min，离心半径9 cm，将血清保存在-70 ℃的冰箱中保存待检测。

1.2.2Real time PCR检测血清miR-34 c和miR-127-3p表达 按照试剂盒说明书抽提细胞总RNA。提取的总RNA各取5 μL至EP管中，加入RNase-Free ddH2O至50 μL，混匀，以RNase-Free ddH2O为对照，使用石英微量比色杯测定A260及A280值，在1.8～2.1。根据A260定量结果，12组RNA抽提产物分别取1 μg RNA用反转录试剂盒进行反转录得到cDNA。将样品彻底混合均匀，短暂离心，37 ℃孵育60 min。逆转录产物-20 ℃保存。根据目标基因的mRNA序列，按照引物设计的原则，用设计软件primer express 3.0设计并合成qPCR检测引物及探针，miR-34 c上游引物：5’-CGCGGATCCTCTATTTGCCATCGTCTA-3’，下游引物：5’-CTGAAGCTTCAGGCAGCTCATTTGGAC-3’； miR-127-3p的上游引物：5’-ACACTCCAGCTGGGTCGGATCCGTCTGAGC-3’，下游引物：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG -3’。目标基因探针和内参基因探针均为5’端采用FAM报告荧光标记，3’端采用TAMRA淬灭荧光标记。取2 μg中RNA加入内参U6和目的小分子RNA miR-34 c和miR-127-3p逆转录引物，在70 ℃反应10 min后，取出立即冰育2 min，随后加入其他试剂。其反应程序为：42 ℃反应60 min，70 ℃反应10 min。立即将cDNA产物取出，快速置冰上冷却-80 ℃以备后用。以逆转录产物为模板，在实时定量PCR仪上进行扩增，其反应条件为：在95 ℃反应3 min，起到起始模板变性；在95 ℃反应15 s，PCR循环中模板变性，然后60 ℃中反应45 s起到退火的作用，共循环35次。采用相对定量的方法对miRNA进行相对量表达进行计算，以2-△△CT法分析基因相对表达量。

1.2.3观察指标 观察结肠癌组、结肠良性肿瘤组和健康对照组的miR-34 c和miR-127-3p表达量变化，并观察结肠癌患者血清miR-34 c和miR-127-3p表达量与临床病理指标的关系及手术后其水平的变化及其相关性。

2 结 果

2.1各组血清miR-34 c和miR-127-3p表达量比较 结肠癌组血清miR-34 c表达量为0.69±0.15，结肠良性肿瘤组为1.65±0.59，健康对照组为2.67±0.98，3组比较差异有统计学意义(F=530.904，P<0.05)，结肠癌组血清miR-34 c表达量明显低于良性肿瘤组和健康对照组(P均<0.05)，而良性肿瘤组明显低于健康对照组(P<0.05)。结肠癌组血清miR-127-3p表达量为3.16±1.06，结肠良性肿瘤组为2.06±0.67，健康对照组为1.19±0.64，3组比较差异有统计学意义(F=120.676，P<0.05)，结肠癌组血清miR-127-3p表达量明显高于良性肿瘤组和健康对照组(P均<0.05)，而良性肿瘤组明显高于健康对照组(P<0.05)。

2.2结肠癌患者血清miR-34 c和miR-127-3p表达与临床病理因素的相关性 结肠癌患者血清miR-34 c和miR-127-3p表达量与年龄、性别、浸润深度、脉管浸润和神经浸润无明显相关性(P均>0.05)，与肿瘤直径、TNM分期、淋巴转移和CEA表达具有明显的相关性(P均<0.05)。见表1。

表1 血清miR-34 c和miR-127-3p表达量与结肠癌临床病理因素的关系

2.3结肠癌患者手术前后血清miR-34 c和miR-127-3p表达的变化 结肠癌根治术后，miR-34 c表达量为1.86±0.81，较术前明显升高(t=19.213，P<0.05)；miR-127-3p表达量为1.16±0.62，较术前明显降低(t=22.032，P<0.05)。

2.4结肠癌患者血清miR-34 c和miR-127-3p表达的相关性 结肠癌患者的血清miR-34 c表达量与miR-127-3p表达量呈明显的负相关(r=-0.684，P<0.05)。

3 讨 论

miRNA是一类非编码单链RNA，是一类小型核糖核酸，长度为18～26个核苷酸[5]。其广泛存在于动物和病毒中，能够通过碱基配对的方式作用于靶mRNA，并在转录后调控靶基因的翻译和表达，对细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭和转移，个体发育和代谢均具有重要作用，参与机体的生理和病理过程。近年来miRNA在结肠癌中的诊断和疗效观察中的作用得到了肯定，但由于标本不易得到，操作过程复杂，一定程度限制了其在临床的应用[6-7]。而外周血中的miRNA长期稳定，并有一定组织特异性，与肿瘤的病理学特征具有密切的联系，在恶性肿瘤的诊断、治疗和预后判断方面具有很高的临床价值[8-9]，被认为是一种非常有前途的肿瘤标记物[10]，为肿瘤的诊断、疗效和预后的判断提供了新的思路。

miR-34 c是miR-34家族的重要成员，在多种肿瘤的形成和发生发展具有重要作用，在肝癌、结肠癌、卵巢癌、鼻咽癌和白血病患者中呈低表达，而转染miR-34 c基因后，肿瘤的发生发展明显受到抑制，说明miR-34 c具有抑癌基因的作用[11-13]。本研究表明结肠癌患者血清miR-34 c表达量明显低于结肠良性肿瘤者和健康对照者，说明miR-34 c可能参与结肠癌的发生和发展过程。本研究还发现结肠癌患者的血清miR-34c表达量与肿瘤直径、肿瘤分期和淋巴结转移具有明显的相关性，结肠癌患者血清miR-34 c表达量越低，则患者肿瘤直径越大、分期越晚和淋巴结转移的可能性越大，而肿瘤的分期和淋巴结是否转移是预后的重要指标，说明miR-34 c在结肠癌的预后判断方面具有重要价值。同时本研究还发现手术后结肠癌患者血清miR-34 c表达量明显高于手术前，因此miR-34 c在在结肠癌形成、发生发展、侵袭和转移过程中扮演着重要角色，具有类似抑癌基因的作用。本研究还发现机体miR-34 c表达量与CEA水平存在相关性，为结肠癌预后的重要指标，但其具体机制仍不清楚。

miR-127-3p在结肠癌和白血病表达增高，在骨肉瘤中表达降低[14]，而在结肠癌患者中的表达情况报道较少。本研究表明结肠癌患者血清miR-127-3p表达量明显高于良性结肠肿瘤者和健康对照者，说明结肠癌患者血清miR-127-3p表达量可以用于结肠癌患者的辅助诊断，其作用与用于恶性胶质瘤的诊断类似[15]。本研究表明结肠癌患者血清miR-127-3p表达与肿瘤直径大小、肿瘤分期、淋巴转移和CEA具有密切的联系，说明结肠癌患者血清miR-127-3p表达与结肠癌的预后具有明确的联系，miR-127-3p表达量越高，结肠癌患者的预后越差，同时结肠癌患者血清miR-127-3p表达有助于结肠癌的早期诊断，但其具体机制尚不清楚。有研究表明miR-127-3p通过抑制sept7的表达，从而达到抑制胶质母细胞瘤的迁移和侵袭作用，在结肠癌患者中是否通过上述机制尚不清楚[16]。本研究还发现结肠癌血清miR-127-3p表达量越高，结肠癌患者血清CEA水平越高，两者可能均为结肠癌预后的重要指标。本研究通过相关性分析发现结肠癌患者血清miR-34 c表达与miR-127-3p表达呈负相关，同样说明两者具有内在联系。故miR-34 c、miR-127-3p和P53基因之间是否存在直接或者间接的联系需要实验的进一步证实。

总之，miR-34 c和miR-127-3p基因参与了结肠癌的发生发展，miR-34 c为抑癌基因，而miR-127-3p为促癌基因，在结肠癌的侵袭和转移过程中具有重要作用。