祛风解痉汤治疗咳嗽变异性哮喘的药理作用

宋苹 张溪 张瞳 张忠德

[摘要] 目的 初步探討祛风解痉汤对咳嗽变异性哮喘（CVA）豚鼠气道炎性反应的影响作用。 方法 40只SPF级雌性豚鼠按随机数字表法随机分为正常对照组、模型组、阳性对照组、中药高剂量组、中药低剂量组，每组8只。采用鸡清白蛋白（OVA）、氢氧化铝腹腔注射致敏并OVA激发法复制CVA豚鼠模型。阳性对照组、中药高剂量组、中药低剂量组于雾化当天开始分别以醋酸泼尼松3 mg/kg、祛风解痉汤32.88 g/kg、祛风解痉汤8.22 g/kg灌胃。正常对照组及模型组给予等量的生理盐水灌胃。检测各组豚鼠咳嗽敏感性（CRS）、支气管肺泡灌洗液（BALF）中嗜酸粒细胞（EOS）百分率及血清中白介素-4（IL-4）、IL-12、IL-13、肿瘤坏死因子β（TNF-β）、γ干扰素（IFN-γ）水平。 结果 模型组CRS、EOS百分率及血清IL-4、IL-12、IL-13、TNF-β、INF-γ表达水平明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。阳性对照组、中药高剂量组、中药低剂量组豚鼠的CRS、EOS百分率明显低于模型组，阳性对照组及中药高剂量组血清IL-4、IL-12、IL-13、TNF-β、INF-γ表达水平明显低于模型组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。③中药高剂量组豚鼠CRS、EOS百分率及血清TNF-β、INF-γ表达水平明显低于中药低剂量组，差异有统计学意义（P < 0.05）； 结论 祛风解痉汤能明显抑制CVA豚鼠CRS，降低CVA豚鼠BALF中EOS百分率，亦能一定程度减轻血清炎性因子表达，相关机制尚需优化处方配伍深入探讨。

[关键词] 祛风解痉汤；咳嗽变异性哮喘；咳嗽敏感性；气道炎性反应

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）08（a）-0014-04

[Abstract] Objective To preliminarily investigate the efficacy of Qufeng Jiejing Decoction on airway inflammation reaction in guinea pigs with cough variant asthma （CVA）. Methods Forty SPF female guinea pigs were divided into five groups with eight Digs in each group by random number table， including control group， model group， positive drug group， low-dose Qufeng Jiejing Decoction group and high-dose Qufeng Jiejing Decoction group. The OVA-induced method， by injecting OVA and aluminum hydroxide （ALP） intraperitoneally， was applied to make guinea pig CVA model. On the date of nebulization， the positive drug group， high-dose and low-dose Qufeng Jiejing Decoction groups were respectively treated with prednisone acetate at 3 mg/kg， Qufeng Jiejing Decoction at doses of 2.88 g/kg and 8.22 g/kg by gavage. The control group and model group were treated with normal saline at the same time. The cough response sensitivity （CRS）， eosinophil （EOS） percentage in bronchoalveolar lavage fluid （BLAF）， as well as levels of serum interleukin -4 （IL-4）， IL-12， IL-13， tumor necrosis factor β （TNF- β） and interferon-γ （IFN-γ） of each group were detected. Results Compared with the control group， the CRS， EOS percentage， and the expression levels of IL-4， IL-12， IL-13， TNF-β and INF-γ in serum of the model group were increased significantly （P < 0.05）. Compared with the model group， the CRS and EOS percentage were significantly decreased in the positive drug group， high-dose and low-dose Qufeng Jiejing Decoction group， while the levels of serum IL-4， IL-12， IL-13， TNF-β and INF-γ were significantly reduced （P < 0.05）. Compared with the low-dose Qufeng Jiejing Decoction group， the CRS， EOS percentage， and the levels of TNF-β and INF-γ in high-dose Qufeng Jiejing Decoction group were reduced significantly （P < 0.05）. Conclusion Qufeng Jiejing Decoction can evidently inhibit the CRS and the EOS percentage of CVA guinea pigs， and also reduce the expression of inflammatory cytokines in their serum to some extent. However， the relevant mechanism is worth investigating and needs further exploration.

[Key words] Qufeng Jiejing Decoction； Cough variant asthma； Cough sensitivity； Airway inflammation

咳嗽变异性哮喘（CVA）是一种常见的慢性咳嗽病因，约占慢性咳嗽原因的1/3[1]。在我国，受气候、环境等各方面因素影响，CVA发病率不断增加。而针对CVA的规范治疗并未引起广泛重视，而且部分患者因症状较轻或考虑到激素类药物的副作用而拒绝用药。近年来，随着研究的深入，国内外学者普遍认为咳嗽敏感性增高以及相应气道神经源性炎症在慢性咳嗽发病中起重要作用[2-4]，CVA也存在咳嗽敏感性增高及气道神经源性炎症改变，因此，抑制气道神经源性炎症并降低咳嗽敏感性成为CVA靶向治疗的有效途径。中医理论认为，CVA的症状表现符合“风性善行數变”“风盛则挛急”“风盛则痒”等特点，属“风咳”范畴。晁恩祥教授据此创立“疏风宣肺、解痉止咳”治法[5-6]，在临床应用普遍。笔者在临床实践中发现，根据祛风解痉立法的祛风解痉汤对CVA早期治疗有一定的优势。结合CVA的发病机制，本研究基于气道神经源性炎症及咳嗽敏感性积极探讨祛风解痉汤的作用及机制，为该处方的应用提供实验依据，也为其进一步开发研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 实验动物 2～3月龄，体重350～450 g的SPF级雌性豚40只，由南方医科大学实验动物中心提供，合格证号：44002100006813。

1.1.2 实验药物 ①祛风解痉汤由炙麻黄5 g（批号：170501601），地龙10 g（批号：170507561），苏叶15 g（批号：170303603），蝉蜕6 g（批号：170408722），炙百部10 g（批号：170465433），炙紫苑10 g（批号：170523 526），前胡10 g（批号：170532143），五味子10 g（批号：170401732），桔梗10 g（批号：170304621）、甘草5 g（批号：170501601）组成，由广东省中医院中药房提供。将上述中药制成粗粉，首剂将粗粉放置8倍温水浸泡0.5 h，沸腾后改文火煎0.5 h，均匀搅拌取汁后经三层纱布过滤；第2次和第3次煎煮均分别以6倍水文火煎0.5 h，同样方法取汁，用旋转蒸发仪进行减压浓缩，水浴温度设为55℃。根据人和豚鼠体表面积换算系数[7]，中药低、高剂量组给药剂量分别为8.22、32.88 g/kg，按照1 mL/200 g豚鼠给药量将药物浓缩至1.644、6.576 g/mL两个不同浓度混悬液，4℃保存备用。②醋酸泼尼松片：厂家浙江仙琚制药股份有限公司；规格5 mg×100 s；批号：160337，给药量为3 mg/kg。

1.1.3 仪器 医用1205型压缩雾化机（德国PARI公司）、玻璃雾化箱（自制），酶标分析仪MK3（Thermo美国），普通光学显微镜（Nikon日本）等。

1.1.4 试验盒 白细胞介素4（IL-4）（Sigma，批号：RAB1529）、IL-12（Sigma，批号：RAB0255）、IL-13（Sigma，批号：RAB0256）、肿瘤坏死因β（TNF-β）（Sigma，批号：RAB0340）、γ干扰素（INF-γ）酶联免疫试剂盒（Sigma，批号：RAB0224）。

1.2 试剂的配制

鸡清白蛋白（OVA）溶液：将1 g OVA干粉（购自GBCBIO Technologies）溶于50 mL生理盐水中先配置成20 g/L OVA溶液，并用生理盐水稀释为10 g/L OVA溶液；氢氧化铝干粉（购自天津惠瑞化工科技有限公司，生产编号：20141111）；辣椒素溶液：取辣椒素（购自SIGMA）30.5 mg，依次加入吐温-80溶液及无水乙醇各1 mL溶解，再加入生理盐水8.0 mL，配成10-2 mol/L的辣椒素原液，取1 mL的辣椒素原液，稀释至100 mL成10-4mol/L溶液。

1.3 实验方法

将40只豚鼠在室温18～24℃下饲养，湿度40%～70%，每天光照10～12 h，自由饮食，适应性喂养1周后，按照随机数字表法随机分为正常对照组、模型组、阳性对照组、中药低剂量组、中药高剂量组，每组8只。①造模方法：造模组在第1、8天每只豚鼠腹腔注射20 g/L OVA 1 mL和200 mg氢氧化铝的混悬液，第15天开始以10 g/L OVA雾化攻击，1次/ d，每次1 h，连续7 d。正常对照组给予相同体积的生理盐水腹腔注射及雾化。②给药方法：于雾化攻击当天起灌胃给药，阳性对照组按照醋酸泼尼松3 mg/kg配成3 mL生理盐水溶液灌胃，中药低剂量组按照8.22 g/kg给予祛风解痉汤低浓度混悬液灌胃，中药高剂量组按照32.88 g/kg给予祛风解痉汤高浓度混悬液灌胃，1次/d，连续7 d。正常对照组和模型组以等体积生理盐水灌胃。所有动物饲养在SPF级环境，12 h/12 h光照循环，自由饮水和食用颗粒饲料。

1.4 观察指标及检测方法

①咳嗽敏感性：利用辣椒素咳嗽激发试验以及全身体积描记法计数结果作为判断依据，即全部雾化攻击完成后的第2天，置豚鼠于全身体描箱内，以10-4 mol/L辣椒素溶液雾化2 min后，观察并记录各组豚鼠5 min的咳嗽次数。②支气管肺泡灌洗液（BALF）中嗜酸性粒细胞（EOS）百分率：激发试验结束后，以2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）灌洗支气管肺泡，灌洗3次，回收支气管BALF。取200 μL BALF离心（转速：3000 r/min，离心半径：15 cm）10 min；转移上清液，加入红细胞裂解液后，同上再离心l0 min；转移上清液，加入等量PBS涂片，苏木精-伊红染色；显微镜下连续视野中观察并计算200个细胞中EOS的百分率。再取100 μL BALF，同法操作，直至“加入等量PBS涂片”，取10 μL细胞计数。③血清炎性介质：腹主动脉采血5 mL，置促凝管静置后离心（转速：3000 r/min，离心半径：15 cm）10 min，分离血清；采用酶联免疫吸附法对IL-4、IL-12、IL-13、TNF-β、IFN-γ的含量测定，方法严格按照试剂盒说明书操作。

1.5 统计学方法

采用统计学软件SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组豚鼠CRS及BALF中EOS百分率比较结果

模型组豚鼠的咳嗽次数及EOS百分率均明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P < 0.05），证明造模成功；阳性对照组、中药低剂量组、中药高剂量组豚鼠的咳嗽次数均明显低于模型组，差异均有统计学意义（P < 0.05）；中药高剂量组豚鼠的咳嗽次数低于中药低剂量组，差异有统计学意义（P < 0.05）。阳性对照组、中药低剂量组、中药高剂量组EOS百分率均明显低于模型组，差异均有统计学意义（P < 0.05）；中药高剂量组EOS百分率明显低于中药低剂量组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2 各組豚鼠血清IL-4、IL-12、IL-13、TNF-β、INF-γ表达水平比较结果

模型组豚鼠IL-4、IL-12、IL-13、TNF-β、INF-γ的表达水平较明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；阳性对照组、中药高剂量组豚鼠IL-4、IL-12、IL-13、TNF-β、INF-γ表达水平均明显低于模型组，差异有统计学意义（P < 0.05）；中药低剂量组豚鼠IL-13表达水平明显低于模型组，差异有统计学意义（P < 0.05）；中药高剂量组豚鼠的TNF-β、INF-γ水平明显低于中药低剂量组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

3 讨论

祛风解痉治法是基于哮喘急性发作时风盛痰阻气道挛急的病机而设，长期以来，其在哮喘的诊治中始终发挥着十分重要的作用[8]。基于CVA与哮喘发病的共同机制，该法在CVA的治疗中得以广泛应用。本研究使用的祛风解痉汤即是在该法指导下，经笔者多年临床实践经验总结的处方。全方以炙麻黄、地龙为君药，共奏疏风宣肺、通络解痉之效；苏叶、蝉蜕、僵蚕为臣，疏风止痉、利咽止痒；炙百部、炙紫菀、前胡宣肺化痰、止咳平喘，五味子敛肺止咳，共为佐使。

根据本研究结果，祛风解痉汤在减轻CVA豚鼠CRS方面较阳性对照药更为有效，这可能与方中炙麻黄及虫类药物的使用有关。现代药理研究表明，炙麻黄对支气管平滑肌的解痉作用更为持久[9]；地龙中含氮化合物在离体实验中对小鼠及家兔表现出较强的支气管舒张作用[10]；蝉蜕和僵蚕除具有抗变态反应作用还能有效缓解支气管平滑肌痉挛[11]。另外，有研究认为，CVA可分为CRS增高和正常两种亚型，而EOS在气道浸润和活化程度不同可能是造成CVA模型CRS差异的重要原因[12]。由此，针对CRS增高的CVA患者，祛风解痉汤可能是更为有效的治疗选择，而EOS在气道浸润和活化程度中的不同作用则可作为其机制研究的途径之一。本文研究结果显示：中药高剂量组较中药低剂量组EOS百分率下降更明显，提示祛风解痉汤治疗能够有效降低CVA豚鼠BALF中的EOS百分率，并且可能与剂量有一定的相关性[13-15]。另外，与阳性对照组比较，本研究采用的祛风解痉汤在减轻CVA豚鼠性反应方面的作用似乎并不理想，这可能与该处方的配伍有一定关系[16-20]。纵观全方，更多的药味作用体现在解痉平喘方面。因此，针对炎性反应明显的CVA患者，临证实践中可对该处方进行适当的加减，从减轻CRS和炎性反应等多方面全方位优化处方，为CVA的治疗提供更为有效的治疗方法。

综上，祛风解痉汤能明显抑制CVA豚鼠CRS，降低CVA豚鼠BALE中EOS百分率，亦能一定程度减轻血清炎性因子表达，其相关机制尚需优化处方配伍深入探讨。

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