经小脑延髓移植骨髓间充质干细胞对受损脊髓白质的影响

明超 曾云 熊敏

[摘要] 目的 觀察经小脑延髓移植骨髓间充质干细胞（BMSCs）对受损脊髓白质的修复作用。 方法 改良Allen法构建大鼠脊髓损伤（SCI）模型，随机分成模型组和BMSCs组。BMSCs组给予10 μL BMSCs悬液，模型组给予等量生理盐水。BBB评分评估术后1、7、14、21、28 d神经功能恢复情况，4.7 T核磁扫描仪研究大鼠脊髓白质变化；HE染色观察SCI后的病理变化；荧光显微镜检测Hoechst 33342标记的BMSCs数目。 结果 SCI术后7、14、21、28 d BMSCs组BBB评分均显著高于模型组（P < 0.05），BMSCs组脊髓白质纵向弥散梯度接近于模型组（P > 0.05）。BMSCs组脊髓病灶中心平均面积明显小于模型组（P < 0.05）。HE染色显示BMSCs组14、28 d脊髓损伤的恢复情况明显优于模型组。BMSCs组术后7 d Hoechst 33342标记的细胞信号水平高于模型组，随后从7 d到1个月逐渐降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 经小脑延髓移植BMSCs对受损脊髓白质的恢复有着积极的促进作用，这为SCI的治疗提供了一种新途径。

[关键词] 骨髓间充质干细胞；小脑延髓；脊髓损伤；脱髓鞘改变

[中图分类号] R744 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）08（a）-0009-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of bone marrow stem cells （BMSCs） transplanted via cisterna magna on the rehabilitation of damaged spinal cord white matter. Methods The spinal cord injury （SCI） model was carried out by a modified Allen method， assigned into the control group and BMSCs group randomly. The BMSCs group and control group were given 10 μL BMSCs suspension and 10 μL physiological saline via cistern magna respectively. BBB scale was utilized to estimate the neurological recovery on 1， 7， 14， 21， 28 d postoperatively after SCI. The white matter changes in the injured spinal cord were tested using 4.7 T MRI scanner. HE staining was applied to access the rehabilitation condition. Flourescence microscope was performed to identify the signal level of Hoechst 33342 marked BMSCs in the injured spinal cord. Results The BBB scores in the BMSCs group were significantly higher than that of the control group on 7， 14， 21， 28 d after SCI （P < 0.05）. There was no statistically significant difference between the two groups regard to the longitudinal diffusion gradients of the damaged spinal cord white matter （P > 0.05）. The average size of the lesion center in the BMSCs group was significantly smaller than that of the control group （P < 0.05）. HE staining revealed that the recovery of the BMSCs group was better than the control group at 14， 28 d after SCI. The counts of Hoechst 33342 labelled cells were less in the control group than that in the BMSCs group at 7 d. Subsequently， they continued to decrease from 7 d to 4 weeks later， with highly statistically significant difference （P < 0.01）. Conclusion Bone marrow mesenchymal stem cells transplanted via cisterna magna has a positive role in promoting the rehabilitation of damaged spinal cord white matter， which is a novel way of treating SCI.

[Key words] Bone marrow stem cells； Cisterna magna； Spinal cord injury； Demyelinating changes

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）的恢复是再生医学中的一个亟待解决的问题。骨髓间充质干细胞（bone marrow stem cells，BMSCs）具有良好可塑性及分化成不同类型细胞的能力，占骨髓单核细胞总数的0.001%～0.01%，而且随年龄增加而减少[1]。研究证实它们除了可以分化为骨骼、软骨、脂肪及肌肉细胞等外，还能够分化为神经元类似细胞及心肌细胞，并且能够分泌一系列保护因子如脑源性生长因子、神经生长因子、胶质细胞源性神经营养因子等[2-3]。近年来，学者对BMSCs的特征、分离及分化的调控进行了大量研究。研究表明，BMSCs治疗中枢神经系统创伤时，能够刺激肺巨噬细胞和脾脏调节性T细胞产生而发挥远程“生物反应器”作用，进而促进循环系统中抗炎细胞因子的产生，并改善其微环境[4]，同时也可以与移植区域的细胞沟通，从而分泌保护因子，促进损伤恢复[5]。Tsumuraya等[6]发现，在小鼠脊髓横断损伤模型中，通过激活脑垂体腺嘌呤环化酶激活多肽基因，BMSCs可以通过降低促炎因子表达，同时促进抗炎因子表达从而抑制炎性反应，修复损伤组织。BMSCs移植治疗SCI的途径众多，而经小脑延髓移植却少见报道，本实验将探讨经小脑延髓途径移植BMSCs到大鼠SCI部位后对受损脊髓白质的影响，从而为SCI的治疗提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

SPF级雌性SD大鼠45只饲养于屏障环境内[湖北医药学院实验动物中心，合格证号：SCXK（鄂）2016-0031]，40只（3月龄，250～300 g）采用随机数表法分成模型组（n = 20）和BMSCs组（n = 20），5只（2～3周龄，45～65 g）用于获取BMSCs。试剂：DMEM培养基及胎牛血清（美国GBICO公司）；兔抗大鼠CD34、小鼠抗大鼠CD90及CD105、驴抗小鼠FITC及PE、驴抗兔PE（英国abcam公司），HE染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。

1.2 仪器

脊髓损伤打击器（美国Keck神经外科研究中心）、大鼠脑定位仪（美国Stoelting公司）、CO2细胞培养箱（日本三洋公司）、CKX41倒置显微镜（日本Olympus公司）、XSP-63X荧光显微镜（日本Nikon公司）、FACS流式细胞仪（美国BD公司）、4.7 T核磁扫描仪（英国Resonance Instruments公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 模型构建 改良Allen法构建大鼠SCI模型[7]。术后分笼喂养，每日行人工排尿两次，直至自主排尿功能恢复。

1.3.2 BMSCs分离培养 2～3周龄SD大鼠断颈处死，取双侧股骨和胫骨，剪开骨髓腔，2%FBS-DMEM反复冲洗髓腔获取单细胞悬液离心、弃上清，混匀后接种于T25培养瓶中。细胞培养箱中孵育48 h冲洗去除未贴壁的造血细胞，每2～3天换液1次。待细胞融合至80%～90%时传代。

1.3.3 BMSCs表型鉴定 第三代BMSCs胰酶消化后制成细胞悬液，分别加入兔抗大鼠CD34、小鼠抗大鼠CD90及CD105 1 μL（1∶50），混匀后4℃避光孵育1 h，PBS洗涤后加入驴抗小鼠FITC、驴抗兔、驴抗小鼠PE 1 μL（1∶50），混匀后室温避光孵育20 min，离心后加入500 μL PBS，转移至流式管上机。

1.3.4 BMSCs标记及移植 第三代对数期BMSCs移植前1 h加入Hoechst33342 20 μL標记，制成终浓度为3×107/mL的BMSCs悬液备用。细胞移植同文献报道方法[8-9]。BMSCs组给予10 μL Hoechst 33342标记的细胞悬液（约3×107/mL），模型组给予等量生理盐水。

1.3.5 大鼠神经功能评估 参照BBB评分[10]评估大鼠后肢运动功能恢复情况。两组大鼠分别在术后1、7、14、21、28 d取4只采用双盲、二人独立评分评估双后肢恢复情况。

1.3.6 形态学评估 采用4.7 T核磁扫描仪扫描脊髓白质获取矢状面和轴向T2加权和弥散加权图像，参数如下：回声时间（TE=32 ms）、重复时间（TR=3 s）、视野（FOV=2.5 cm）、图像大小（128×128）、切片厚度（1.5 mm）。信号累积（NA=6）以提高信噪比，所有测量与大鼠呼吸节律一致从而消除运动伪影。

1.3.7 脊髓取材及HE染色 术后1、14、28 d于两组随机选取2只大鼠麻醉后经升主动脉灌注4℃生理盐水250 mL后改用4%多聚甲醛溶液250 mL。随后取出T10脊髓组织固定后行HE染色。

1.3.8 BMSCs计数 大鼠灌注参照上文所述，脊髓取出后在冰冻切片机中制作T9～11连续横切片（4 μm）。每只动物取10张片，荧光显微镜下记录Hoechst 33342标记BMSCs数目。

1.4 统计学方法

应用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs形态观察及表面标志物鉴定

大鼠原代BMSCs培养24 h后逐渐贴壁，呈圆形，含较多杂细胞；48 h后细胞形态呈多样化，形态不规则。7～10 d可见细胞呈现克隆式生长，融合成梭形或多角形，呈漩涡状或放射状排列。第三代BMSCs形态规整、排列整齐，呈长梭形。流式细胞仪鉴定BMSCs表面标志物阳性率分别为CD34 1.51%、CD90 98.9%、CD105 99.9%。见图1～2。

2.2 脊髓损伤形态学改变

SCI术后7 d内所有大鼠后肢运动、感觉功能丧失。术后1 d，中度损伤大鼠可见脊髓组织连续性中断、表面变性坏死，损伤周围区域亦有不同程度的变性坏死，假手术组大鼠脊髓完整，未见明显出血坏死。见图3。

2.3 BBB运动评分

SCI后第1天BMSCs组与模型组BBB运动评分比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。第7天开始，BMSCs组各个时间点BBB评分均高于模型组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.4 SCI后HE染色形态变化

模型组术后1 d脊髓组织内灰、白质界限不清，可见大量片状出血，细胞数目减少，呈现一片“荒芜”现象。术后14 d脊髓组织内神经纤维排列疏松、断裂，神经元细胞稀少，胶质细胞增生，可见空洞及瘢痕形成。术后28 d模型组灰质内神经元有所恢复，白质被瘢痕组织侵蚀、连接，瘢痕组织内未见明显的神经纤维再生。BMSCs组术后1 d脊髓内可见点、片状出血，细胞肿胀、消失；术后14 d受损脊髓组织局部空洞，少量瘢痕组织形成，神经细胞较多；术后28 d脊髓组织内无明显空洞及瘢痕组织形成，有大量神经细胞分布于脊髓组织内。见图4。

2.5 核磁量化分析白质恢复情况

MRI结果显示，BMSCs组脊髓白质未出现创伤后囊肿，而模型组可见明显的创伤后脊髓空洞症。术后28 d，脊髓白质弥散参数量化数据（表2）示，BMSCs组脊髓白质纵向弥散梯度接近于模型组，差异无统计学意义（P > 0.05），且这些结果接近于正常参考值。BMSCs组脊髓病灶中心平均面积明显小于模型组，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.6 BMSCs迁移数目测定

荧光显微镜观察示术后7 d BMSCs组损伤处Hoechst 33342阳性细胞数目显著高于模型组（图5），从第7天开始，BMSCs组脊髓损伤部位Hoechst 33342阳性细胞信号水平开始下降，由第7天的（968.5±321.7）个/mm2逐步下降至第1个月的（71.8±48.2）个/mm2，差异有统计学意义（t = 5.318，P < 0.01）。

3 讨论

脊髓分灰质和白质，灰质主要由神经细胞构成，白质主要由轴突组成。与其它研究不同，本研究关注细胞移植治疗脊髓白质损伤的效果，而非神经元。结果表明，经小脑延髓移植BMSCs能促进SCI大鼠形态学恢复，并改善其运动功能。虽然荧光显微镜下证实BMSCs随着损伤时间延长，数目减少，这可能与SCI后微环境恶劣有关，但不可否认的是大鼠运动功能有所恢复。研究表明，BMSCs保护SCI有两种可能的机制：限制创伤性SCI的程度、促进细胞存活和轴突再生[11]。轴突脱髓鞘对神经功能退化非常敏感，通过少突胶质细胞促进髓鞘再生对于限制轴突变性至关重要，而后者则会导致受损区域向周边脊髓组织扩散[12-13]。最终，脊髓白质会严重受损，形成典型的创伤后囊肿，这在人类和实验大鼠中都能观察到。

BMSCs也可能通过影响细胞间联系从而促进损伤修复以及刺激轴突生长。BMSCs分化除受细胞之间相互作用的影响，还受如损伤脊髓组织微环境的影响。因此，在复杂的SCI微环境中很难预测移植的BMSCs行为；但移植细胞向创伤区域迁移的能力决定了其向受损脊髓节段胶质瘢痕区域渗透的能力，这在修复缺失的神经功能中起到至关重要的作用。研究表明，移植的BMSCs能够渗透进入创伤后脊髓囊肿中，并能促进大鼠脊髓轴突再生[14]，这可能与囊腔内的BMSCs分化为脊髓细胞群有关。

经小脑延髓移植是经蛛网膜下腔注射移植治疗SCI的方式之一。蛛网膜下腔移植途径具有可多次注射、创伤小、不受血脑屏障限制、临床可行性高等优点[15]，在实践中通常采用经腰椎注射的方式。但在重力作用下，移植细胞大多停留在腰骶部，导致细胞移植效率降低。相比而言，经小脑延髓移植具有更多优势。从脑脊液的生理循环来看，BMSCs在脑脊液循环及重力的双重作用下可以最大程度到达SCI区域，从而改善移植细胞的存活、迁移、归巢以及分化能力，促进脊髓白质再生[16-17]。研究证实BMSCs在促进SCI后神经功能恢复中的作用与移植细胞分化成某种特定的细胞群体无关[18]。在体外条件下，BMSCs能够显著改善神经传导作用[18]。Xiong等[19]研究表明尽管移植的BMSCs只有部分分化为少突胶质细胞和星形胶质细胞，但行为学评分证实SCI大鼠后肢功能得到显著改善。

综上所述，经小脑延髓移植BMSCs对受损脊髓白质的恢复有着积极的促进作用，是一种有效的途径。但是这些细胞修复中枢神经系统的确切机制尚有待于进一步研究。

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