HPLC同时测定黑老虎药材中2种三萜酸的含量

彭富全 陈明权 何风雷 杨能英 蒋向军 农根林

[摘要] 目的 建立黑老虎中12-乙酰氧基黑老虎酸和开环新五味子酸A的含量测定方法。 方法 采用超声法提取药材，色谱柱为Atlantis T3-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液（80∶20），检测波长：210 nm，流速1.0 mL/min，柱温为30℃。 结果 12-乙酰氧基黑老虎酸进样量在0.0157～0.3140 μg与峰面积值呈现良好的线性关系（r = 0.9998），平均回收率为100.4%，相对标准差（RSD）为2.58%（n = 6）；开环新五味子酸A进样量在0.0848～1.6960 μg与峰面积值呈现良好的线性关系（r = 0.9999），平均回收率为101.1%，RSD为1.21%（n = 6）。 结论 该方法准确、简便、重复性好，可用于黑老虎药材中12-乙酰氧基黑老虎酸和开环新五味子酸A的含量测定。

[关键词] 黑老虎；12-乙酰氧基黑老虎酸；开环新南五味子酸A；高效液相色谱

[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）08（a）-0031-04

[Abstract] Objective To establish a method for the determination of 12-acetoxycoccinic acid and seco-neokadsuranic acid A in root of Kadsura coccinea. Methods Ultrasonic method was used to extract the herbs. HPLC chromatographic conditions included the Atlantis T3-C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm） column， using acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution （80∶20） as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 310 nm and the column temperature was maintained at 30℃. Results The calibration curve of 12-acetoxycoccinic acid was in good linearity over the range of 0.0157-0.3140 μg （r = 0.9998）. The average recovery was 100.4% with RSD of 2.58% （n = 6）. And the calibration curve of seco-neokadsuranic acid A was in good linearity over the range of 0.0848-1.6960 μg （r = 0.9999）. The average recovery was 101.1% with RSD of 1.21% （n = 6）. Conclusion The method is accurate， simple， reproducible， and can be used to determine the content of 12-acetoxycoccinic acid and seco-neokadsuranic acid A in the root of Kadsura coccinea.

[Key words] Kadsura coccinea； 12-acetoxycoccinic acid； Seco-neokadsuranic acid A； High performance liquid chromatography

黑老虎為五味子科南五味子属植物厚叶五味子Kadsura coccinea（Lem.）A.C. Smith的干燥根，别名冷饭团、布福娜、绯红南五味子、过山龙藤、钻地风等，主要分布于我国广东、广西、福建等岭南地区，以及越南、缅甸等东南亚国家[1]。味辛、性温，具有行气活血、祛风止痛的功效，主要用于治疗风湿痹痛、痛经、脘腹疼痛、跌打损伤等；常用于胃、十二指肠溃疡、慢性胃炎、急性胃肠炎、风湿性关节炎等病[2]，为名优中成药“舒筋健腰丸”“壮腰健肾丸”等产品的主要原料药之一。现代研究表明，黑老虎主要含有木脂素和三萜类化合物，它们具有抗肝炎、抗HIV病毒、抗肿瘤、抗氧化、血小板活化因子拮抗作用及对血管平滑肌的舒张作用等药理活性[3-5]。

目前，《广东省中药材标准》等地方标准对黑老虎的质量控制项中，仅有性状鉴别、显微鉴别及薄层鉴别，无“含量测定”项[2]。近年来，国内外许多学者对黑老虎的研究主要集中于繁殖、栽培、化学成分及药理作用等方面，其中，有效活性成分一直都是研究的重点[6-18]。文献调研可知，木脂素类和三萜类是黑老虎的主要生物活性成分，其中三萜酸类成分“12-乙酰氧基黑老虎酸”具有显著的抗HCV活性，可用于制备抗丙肝病毒的药物[19]；“开环新五味子酸A”也具有一定的抗癌活性[20]，而关于黑老虎中三萜酸类成分定量分析的文献尚未见报道。本研究首次建立了高效液相色谱法（HPLC）同时测定不同产地黑老虎中两种三萜酸（12-乙酰氧基黑老虎酸、开环新五味子酸A）的含量，以期为黑老虎药材的资源合理开发及品质评价提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200高效液相色谱议（美国安捷伦公司）；Atlantis T3-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美国安捷伦公司）；Agilent DAD检测器（美国安捷伦公司）；Millpore simplicity-67120型超纯水器（美国密理博公司）；BS110S型万分之一电子分析天平（德国赛多利斯公司）；WXJ型粉碎机（上海凯旋中药机械制造有限公司）；KQ-100DV超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品12-乙酰氧基黑老虎酸（上海一林生物科技有限公司，批号：20171011，纯度98%）；对照品开环新南五味子酸A（上海一林生物科技有限公司，批号：20171011，纯度98%），由该公司从黑老虎药材中分离得到晶体化合物，通过对其进行结构解析、鉴定，发现该化合物的光谱数据、理化常数与文献[20]报道的seco-neokadsuranic acid A完全一致，因此，可以确定黑老虎中也具有開环新南五味子酸A成分。乙腈（Fisher，色谱纯）；冰醋酸（天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯）；液相用水超纯水，其他试剂均为分析纯。

8个黑老虎药材样品，分别采自广东（S1～S4号）、广西（S5～S6号）、福建（S7～S8号），以上样品均经广州中医药大学中药鉴定教研室主任黄海波副教授鉴定为五味子科南五味子属植物冷饭团Kadsura coccinea（Lem.）A.C. Smith的根。样品具体信息见表1。

2 方法与结果

2.1 HPLC色谱条件

色谱柱为Atlantis T3-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液（80∶20）。检测波长：210 nm；流速1.0 mL/min；柱温为30℃；进样量：10 μL。在该条件下，混合对照品及黑老虎样品的色谱图见图1。

2.2 供试品溶液的制备

取黑老虎样品粉末0.50 g（过60目筛），精密称定，置100 mL锥形瓶中，精密加入95%乙醇50 mL，称定重量，超声提取45 min，放冷至室温，补重，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 对照品溶液的制备

分别精密称取12-乙酰氧基黑老虎酸1.57 mg，开环新五味子酸A 8.48 mg对照品，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为15.7、84.8 μg/mL的混合对照品溶液。4℃保存备用。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取上述混合对照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，按“2.1”项色谱条件下进样分析，以各成分峰面积 Y为纵坐标，以进样量X（μg）为横坐标，绘制标准曲线，并求出12-乙酰氧基黑老虎酸和开环新五味子酸A的回归方程分别为Y = 0.2321X + 0.101（r = 0.9998）和Y = 0.4719X + 0.1502（r = 0.9999）。结果显示，12-乙酰氧基黑老虎酸和开环新五味子酸A的进样量分别在0.0157～0.3140 μg和0.0848～1.6960 μg之间与峰面积值呈现良好的线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取混合对照品混合溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测得峰面积积分值，计算相对标准偏差（RSD），结果12-乙酰氧基黑老虎酸的RSD为1.35%，开环新五味子酸A的RSD为0.96%，提示仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验

取供试品溶液，分别在0、3、6、12、24、48 h按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算得12-乙酰氧基黑老虎酸峰面积的RSD为1.62%，开环新五味子酸A的RSD为1.07%，提示供试品溶液在48 h内稳定。

2.7 重复性试验

精密称取同一供试样品6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行HPLC分析。测得峰面积积分值，计算相对标准偏差，结果12-乙酰氧基黑老虎酸峰面积的RSD为1.97%，开环新五味子酸A的RSD为1.21%，提示方法重复性良好。

2.8 加样回收试验

精密称取已测定的黑老虎药材（编号：S5）粉末0.50 g，共6份，分别精密加入12-乙酰氧基黑老虎酸对照品溶液（浓度为0.038 mg/mL）和开环新五味子酸A对照品溶液（浓度为0.482 mg/mL）各1 mL，按供试品溶液制备方法制备，进样10 μL，注入HPLC色谱仪，测其峰面积，计算回收率。12-乙酰氧基黑老虎酸平均回收率为100.4%，RSD为2.58%（n = 6），开环新五味子酸A平均回收率为101.1%，RSD为1.21%（n = 6）。见表2。

2.9 样品的测定

取不同产地黑老虎样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定含量，结果见表3。从表3可以得知，8个产地黑老虎中2种三萜酸的含量存在明显差异，不同产地药材中12-乙酰氧基黑老虎酸的含量大小依次为福建永定>广西防城港>广西恭城>广东怀集>广东始兴>福建武平>广东蕉岭、广东佛冈，而开环新南五味子酸A的含量大小依次为广西防城港>广东蕉岭>广西恭城>福建武平>福建永定>广东始兴>广东怀集>广东佛冈，其中12-乙酰氧基黑老虎酸、开环新南五味子酸A含量均较高的产地为广西防城港（0.076、0.964 mg/g），较低的为广东佛冈（0.001、0.235 mg/g）。

3 讨论

3.1 HPLC色谱条件的优化

3.1.1 流动相的确定 比较了甲醇-水、乙腈-水及在流动相中添加一定浓度的磷酸等流动相组成，使用甲醇-水、乙腈-水系统进行洗脱，各峰的对称性和分离度差；而使用甲醇-0.1%磷酸水溶液系统进行洗脱，各峰的保留时间较长；以乙腈-0.1%磷酸水溶液系统为流动相进行洗脱，被分析物的峰对称性好，分离度满足要求，保留时间也较理想。故实验选用乙腈-0.1%磷酸水溶液系统作为流动相。

3.1.2 检测波长的选择 将三萜酸混合对照品溶液注入HPLC仪器，应用DAD检测器在190～400 nm波段扫描，再与单组份对照品溶液相对照，发现两种三萜酸组分的最大紫外吸收波长均为200 nm；但在此波长下，溶剂末端吸收较严重，基线不够理想。为提高信噪比，保证基线平稳，消除噪音对定量分析的影响，故选择210 nm为检测波长。

3.2 供试品溶液制备方法的优化

考察了甲醇、75%甲醇、95%乙醇等提取溶剂，结果显示，3种提取溶剂的提取量不存在显著性差异；因此，选择安全系数较大的95%乙醇作为提取溶剂。比较了采用95%乙醇超声提取30、45、60 min 的效果，结果显示，30 min的提取率低于45 min的提取率，而45、60 min的提取量不存在顯著性差异，因此选择95%乙醇超声提取45 min作为制备供试品溶液的方法。

3.3 小结

实验测定了8个不同产地黑老虎药材中12-乙酰氧基黑老虎酸和开环新南五味子酸A的含量，结果显示，不同产地药材中两种三萜酸的量之间均存在明显差异，可能与药材采收时间、储藏时间、生长年限以及生长环境等因素有关，具体原因有待于进一步研究。

本研究首次建立了HPLC法同时测定黑老虎药材中12-乙酰氧基黑老虎酸和开环新南五味子酸A等两种三萜酸类成分的量，方法简便、准确、稳定性好，为黑老虎药材质量控制提供了一定的参考。

[参考文献]

[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1996：252-261.

[2] 广东省中药材标准编辑委员会.广东省中药材标准[M].广州：广东科技出版社，2004：188-189.

[3] 舒永志，成亮，杨培明，等.黑老虎的化学成分及药理作用研究进展[J].中草药，2011，42（4）：805-813.

[4] 梁忠厚，范适，宋光桃，等.黑老虎的研究进展[J].湖南生态科学学报，2017，4（3）：52-56.

[5] 李贺然.新型羊毛甾烷类化合物、其制备方法及抗癌用途：中国，CN101607886A[P].2009-12-23.

[6] 杨锐培，王洁，王德勤，等.黑老虎栽培技术及其混伪品鉴定研究进展[J].安徽农业科学，2018，46（8）：26-28.

[7] 刘乘风，李少军，杨彦辉.野生黑老虎人工种植技术研究[J].林业与生态，2017（12）：33-34.

[8] 梁忠厚，李有清.湖南低海拔地区黑老虎引种试验研究[J].湖南生态科学学报，2018，5（1）：28-31.

[9] 李艳，陈骏，黎开燕，等.冷饭团的抗炎作用及其机制研究[J].现代中西医结合杂志，2014，23（25）：2745-2747.

[10] 王来友，王凤云，王集华，等.壮药黑老虎根提取物对大鼠非酒精性脂肪肝病的作用及机制[J].广东药学院学报，2015，31（6）：1-4.

[11] 方灵芝.黑老虎的化学成分及抗氧化活性研究[D].天津：南开大学，2013.

[12] 舒永志，成亮，曺濬喆，等.黑老虎的化学成分研究[J].中草药，2012，43（3）：428-431.

[13] 王楠，李占林，刘晓秋，等.黑老虎根化学成分的研究（Ⅱ）[J].中国药物化学杂志，2012，22（4）：305-309.

[14] 延在昊，成亮，孔令义，等.黑老虎化学成分及其抗氧化活性研究[J].中草药，2013，44（21）：2969-2973.

[15] 王楠，李占林，华会明.黑老虎根化学成分的研究[J].中草药，2010，41（2）：195-197.

[16] Wang N，Li ZL，Song DD，et al. Lanostance-type triterpenoids from the roots of Kadsura coccinea [J]. Nat Prod，2008，71（6）：990-994.

[17] 陆俊，刘如如，赵雪萌，等.黑老虎活性成分及生理活性研究进展[J].食品研究与开发，2018（2）：219-224.

[18] 石柳柳，李贺然.黑老虎中倍半萜类化合物的分离鉴定及抑制NO生成作用研究[J].中国医药导报，2016，13（10）：27-29.

[19] 宋琰，朱勇喆，赵庆杰，等.12-乙酰氧基黑老虎酸在制备防治丙型肝炎病毒药物中的应用：中国，CN103961-357A[P].2014-08-06.

[20] Lian-Niang L，Hong X，Da-Lun G，et al. Isolation and Structure Elucidation of Seco-neokadsuranic Acid A and 3，4-Seco-（24Z）-lanosta-4（30），8，24-triene- 3，26-dioic Acid 1 [J]. Planta medica，1989，55（3）：300-302.