二甲双胍对大鼠肾缺血再灌注损伤后纤维化的影响

苏娟

[摘要] 目的 探讨二甲双胍对大鼠肾脏缺血再灌注后纤维化改变的保护作用。 方法 采用随机数字表法将24只SD雄性成年大鼠分为假手术（Sham）组、缺血再灌注（I/R）组和二甲双胍（Metformin）处理组，每组8只。再灌注12周后，检测各组大鼠血清肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）水平，苏木精-伊红（HE）染色和Masson染色观察肾组织结构变化和纤维化改变；免疫组织化学观察α-平滑肌肌动蛋（α-SMA）和转化生长因子-β1（TGF-β1）分布；Western blot进一步检测α-SMA和TGF-β1的表达水平。 结果 Sham组、I/R组和Metformin组间Cr和BUN比较差异无统计学意义（P > 0.05）。与Sham组比较，I/R组和Metformin组大鼠肾脏出现了明显间质纤维化，但是Metformin组与I/R组比较肾脏间质纤维化明显减轻；与Sham组比较，I/R组和Metformin组大鼠肾脏α-SMA和TGF-β1的表达水平显著升高，Metformin组与I/R组比较，大鼠肾脏α-SMA和TGF-β1的表达水平显著降低；差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 肾脏缺血再灌注损伤可以引起小管间质纤维化，二甲双胍处理可以减轻此病理改变，其作用可能与二甲双胍能够抑制α-SMA和TGF-β1表达相关。

[关键词] 缺血再灌注损伤；二甲双胍；肾；纤维化

[中图分类号] R692.6 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）08（a）-0022-05

[Abstract] Objective To assess the potential effects of Metformin on the development of tubulointerstitial fibrosis after acute renal ischemia-reperfusion. Methods Twenty-four male Sprague Dawley rats were randomly assigned to three groups： Sham group， I/R group and Metformin group （n = 8）. Twelve weeks after reperfusion， levels of serum urea nitrogen （BUN） and creatinine （Cr） were assessed； Hematoxylin-eosin （H&E;） and Masson′s trichrome staining were used to assess renal fibrosis； the expression spot and protein levels of α-smooth muscle actin （α-SMA） and transforming growth factor-β1 （TGF-β1） were analyzed by immunohistochemistry （IHC） and Western blot. Results There was no statistically significant difference in levels of Cr and BUN among Sham group， I/R group and Metformin group （P > 0.05）. Compared with the Sham group， tubulointerstitial fibrosis was more obvious in the I/R group and the Metformin group； however， the level of tubulointerstitial fibrosis in the Metformin group was less than that of the I/R group. Compared with the Sham group， the levels of α-SMA and TGF-β1 were significantly increased in the I/R group and the Metformin group， the expression of α-SMA and TGF-β1 in the Metformin group were significantly decreased compared with those in the I/R group； the differences were statistically significant （P < 0.01）. Conclusion Administration of metformin significantly attenuated tubuleinterstitial fibrosis following I/R in rats， potentially via down-regulating expressions of α-SMA and TGF-β1.

[Key words] Ischemia-reperfusion injury； Metformin； Renal； Fibrosis

缺血再灌注損伤（ischemia/reperfusion injury，I/R）在肾移植、肾部分切除手术、肾动脉狭窄、主动脉搭桥手术、栓塞性疾病、意外或医源性损伤等过程中不可避免，是临床诊疗过程中常见的一种病理生理改变[1-2]。肾缺血可导致急性再灌注损伤，从而导致肾功能延迟恢复，并可能导致肾脏纤维化改变，进而产生慢性肾功能损害[3-4]。二甲双胍（Metformin）是一种常用的口服降糖药，用于治疗2型糖尿病。单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）可以通过抑制合成代谢，促进分解代谢，增加ATP的合成，并降低ATP的利用，从而满足缺血组织的能量需求，参与脂肪酸氧化、葡萄糖转运、糖酵解、三酰甘油合成和蛋白质合成等一系列生物过程[5-9]。二甲双胍能够激活AMPK[10]，并已经被证实能缓解心脏缺血后的炎性反应，保护心脏功能[11]；AMPK激动剂被证实在体外和SD大鼠、犬体内均能减轻肾上皮细胞的缺血再灌注损伤[12-13]；此外，AMPK活化还能够抑制心脏纤维化和肝纤维化过程[14-15]。但是，目前鲜有相关文献报道二甲双胍对缺血再灌注损伤造成的肾脏慢性纤维化是否具有保护作用。本研究采用SD大鼠构建肾缺血再灌注损伤慢性纤维化模型，探讨二甲双胍对肾缺血再灌注损伤导致的慢性纤维化是否具有保护作用，并探索其中可能涉及的相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

24只健康成年雄性SD大鼠（SPF级），月龄6～8周，体重200～250 g，平均（235.3±6.5）g，均由武汉大学医学院实验动物中心提供（动物质量合格证号：4200980000106）。通过随机数字表法将大鼠随机分为3组：假手术组（Sham组）、对照组（I/R组）和二甲双胍处理组（Metformin组），每组各8只。

1.2 仪器与试药

α-平滑肌肌动蛋（α-SMA，19245）购自Cell Signaling Technology公司、转化生长因子-β1（TGF-β1，sc-130148）和β-肌动蛋白（β-actin，sc-47778）单克隆抗体均购自Santa Cruz公司。血清Cr和BUN检测采用全自动生化分析仪（Olympus，型号Au2700）。

1.3 动物模型的建立

大鼠在动物房，配置好饲料、饮水、垫料，做好通风，12 h/12 h明暗交替适应性喂养2周后，术前禁食12 h，禁水8 h，腹腔注射3%戊巴比妥钠（4390-14-3，购自Sigma）30 mg/kg麻醉。Sham组：麻醉成功后，经腹正中切口进入腹腔，先切除右肾，游离左侧肾脏及肾蒂，但不夹闭肾蒂，手术后缝合关闭腹壁。I/R组：手术过程与Sham组相同，在切除右肾之后充分暴露并游离左肾及肾蒂，并将左肾蒂夹闭45 min然后开通恢复灌流，构建缺血再灌注模型。观察肾脏由暗红色变为红色则表示复灌成功。Metformin组：手术过程同I/R组，从术后第1天开始连续经腹腔注射二甲双胍125 μg/（kg·d），连续给予12周。

1.4 标本采集和处理

分别于缺血再灌注模型建立12周后，处死并收集静脉血和肾脏组织标本。麻醉后，经下腔静脉采血，然后处死各组大鼠，收集肾脏组织，一部分迅速置入液氮罐中保存待行蛋白免疫印迹法（Western blot）检测；另一部分用4%多聚缓冲甲醛溶液固定后，常规石蜡包埋，待行HE染色和免疫组化分析。

1.4.1 大鼠肾功能测定 采用全自动生化分析仪（Olympus，型号Au2700）测定每组大鼠血清肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）水平。

1.4.2 组织病理形态学 取大鼠肾组织，先用多聚甲醛固定，然后脱水、透明、浸蜡、包埋，再切片、脱蜡，行苏木精-伊红（HE）染色，然后在400倍光镜下观察其病理改变并拍照；石蜡切片脱蜡蒸馏水洗后，苏木精染液染核5 min，丽春红酸性复红液染5 min，2%冰醋酸水洗后，1%磷钼酸分化3 min。用苯胺蓝染5 min后，将切片依次放入95%乙醇、无水乙醇、二甲苯中，最后中性树胶封固。在400倍光镜下观察染色情况。肾小管间质纤维化程度的评估，以皮质和外髓质部受损面积占每高倍镜（400×）面积的百分比来判断。

1.4.3 肾脏免疫组织化学 肾组织切片以新鲜配制的体积分数为3%的H2O2灭活细胞内源性过氧化物酶，然后用血清封闭，根据测试指标分别滴加α-SMA和TGF-β1抗体以及相应生物素化二抗，DAB显色，封片。

1.4.4 Western blot检测 取各组小鼠肾用RIPA组织细胞裂解液匀浆后裂解，提取细胞总蛋白SDS-PAGE进行蛋白质分离，电转至NC膜，5%脱脂奶粉封闭1 h后，TBS洗膜。封闭液中按1∶1000加一抗即兔抗鼠α-SMA和TGF-β1单克隆抗体（β-actin作为内参），缓慢摇动4℃过夜，弃去一抗，TBST洗膜，加羊抗兔IgG二抗，缓慢摇动1 h，TBST洗膜。化学发光法曝光（ECL显示法），显影、定影后，拍照观察胶片上的条带，Imag J软件分析灰度。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾功能变化

三组大鼠血清Cr和BUN水平的比較，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图1。

2.2 组织学改变

光镜下可见Sham组中的肾脏结构未见明显改变，而I/R组中的肾脏明显破坏，近曲小管的上皮细胞明显坏死，可见大量炎症细胞浸润，可见管型。而Metformin组的肾脏组织损伤与缺血再灌注组比较相对较轻，近曲小管近端坏死明显减少，偶见管型。见图2（封四）。

Masson染色显示，与Sham组比较，I/R组和Metformin组大鼠肾脏纤维化病变明显；而与I/R组比较，Metformin组可以减轻因缺血导致的纤维化改变。各组纤维化程度比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图3（封四）、表1。

2.3 免疫组织化学表现

α-SMA主要表达于肾小管间质区，而TGF-β1主要表达于肾小管上皮细胞内，二者的阳性表达区域与肾小管间质纤维化病变区分布一致。I/R组和Metformin组大鼠肾脏α-SMA和TGF-β1水平均明显高于sham组（P < 0.01）；而与I/R组比较，Metformin组的上述指标水平显著下降（P < 0.01）。见图4（封四）、表2。

2.4 Western blot检测

Western blot检测结果显示，I/R组、Metformin组与Sham组比较，α-SMA的表达明显增加，差异有统计学意义（P < 0.05）；Metformin组与I/R组比较，α-SMA的表达明显减少，差异有统计学意义（P < 0.05）。TGF-β1在I/R组、Metformin组的表达明显高于Sham组，差异有统计学意义（P < 0.05）；TGF-β1在Metformin组的表达又低于I/R组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图5。

3 討论

I/R是在缺血的基础上恢复血流后，组织器官的损伤反而加重的现象。肾小管内皮及上皮细胞自身具有一定的修复功能，轻度的急性I/R所导致的肾脏功能及病理损伤是可逆的。但是，随着肾缺血缺氧时间的延长，近期会导致肾的微观结构发生明显改变，引起急性肾功能不全；远期主要表现为肾小管内各种胶原纤维表达增多，导致明显地间质纤维化改变，间质纤维化严重时会导致肾单位减少、肾功能不全，最终可能发展为慢性肾功能衰竭。

有文献报道，因I/R导致的肾功能衰竭的患者都会有不同程度的肾脏结构的改变和功能的损害[16]。在本研究中，术后12周时Sham组、I/R组和Metformin组Cr及BUN水平差异无统计学意义，但在病理形态学上I/R组和Metformin组肾小管仍可见明显损伤后改变。本研究中，HE染色显示Sham组中的肾脏结构未见明显改变，而I/R组中的肾脏结构明显破坏，但在Metformin组中损伤明显减轻；Masson染色显示，在I/R 12周后肾脏出现了明显的肾小管间质纤维化改变；但是，在Metformin组中肾纤维化程度明显减轻。

二甲双胍是一种常用的口服降糖药，近来多项研究证实，它还具有抗炎、抗肿瘤和抗纤维化的作用[17-20]。α-SMA是肌成纤维细胞的重要标志之一，也是细胞外基质的重要来源。一般情况下，α-SMA仅仅在未缺血缺氧肾脏组织的血管中表达，但是在各种缺血缺氧损伤后，α-SMA在整个器官组织中都可以见到表达明显增加。TGF-β1是导致纤维化改变的重要因子[21]，是公认的促纤维化因子，其通过与受体结合活化下游基因，其增加产生一系列导致肌成纤维细胞增多的靶蛋白，引起间质纤维化。本研究免疫组化和Western blot结果均显示，I/R组和Metformin组大鼠肾脏α-SMA和TGF-β1的表达水平均显著高于Sham组；而与I/R组比较，Metformin组的α-SMA和TGF-β1水平显著下降。

综上所述，长时间肾脏I/R会导致肾小管严重损伤，而且这种损伤是不可逆的，远期会引起肾小管间质纤维化改变，导致慢性肾功能不全，二甲双胍可能通过减少促纤维因子α-SMA和TGF-β1的表达，从而减轻肾小管形态学改变、促进肾脏功能的恢复，进而抑制肾小管间质纤维化改变。二甲双胍作为一种最常用的降糖药物，经济实用、服用方便、副作用少，很有潜力成为一种减少肾缺血再灌注损伤的治疗药物。

[参考文献]

[1] Yun Y，Duan WG，Chen P，et al. Ischemic postconditioning modified renal oxidative stress and lipid peroxidation caused by ischemic reperfusion injury in rats[J]. Transplant Proc，2009，41（9）：3597-3602.

[2] Barri YM，Sanchez EQ，Jennings LW，et al. Acute kidney injury following liver transplantation： definition and outcome [J]. Liver Transplant，2009，15（5）：475-483.

[3] Schlondorff DO. Overview of factors contributing to the pathophysiology of progressive renal disease [J]. Kidney Int，2008，74（7）：860-866.

[4] Basile DP，Donohoe D，Roethe K，et al. Renal ischemic injury results in permanent damage to peritubular capillaries and influences long-term function [J]. Am J Physiol Renal Physiol，2001，281（5）：F887-F899.

[5] Kudo N，Barr AJ，Barr RL，et al. High rates of fatty acid oxidation during reperfusion of ischemic hearts are associated with a decrease in malonyl-CoA levels due to an increase in 5-AMP-activated protein kinase inhibition of acetyl-CoA carboxylase [J]. J Biol Chem，1995，270（29）：17 513-17 520.

[6] Russell RR，Bergeron R，Shulman GI，et al. Translocation of myocardial GLUT-4 and increased glucose uptake through activation of AMPK by AICAR [J]. Am J Physiol，1999，277（2 Pt 2）：H643-H649.

[7] Marsin AS，Bertrand L，Rider MH，et al. Phosphorylation and activation of heart PFK-2 by AMPK has a role in the stimulation of glycolysis during ischaemia [J]. Curr Biol，2000，10（20）：1247-1255.

[8] Winder WW，Hardie DG. AMP-activated protein kinase，a metabolic master switch： possible roles in type 2 diabetes [J]. Am J Physiol，1999，277（1 Pt 1）：E1-E10.

[9] Kimura N，Tokunaga C，Dalal S，et al. A possible linkage between AMP-activated protein kinase （AMPK） and mammalian target of rapamycin （mTOR） signalling pathway [J]. Genes Cells，2003，8（1）：65-79.

[10] Viollet B，Lantier L，Devin-Leclerc J，et al. Targeting the AMPK pathway for the treatment of type 2 diabetes [J]. Front Biosci，2009，14：3380-3400.

[11] Messaoudi SE，Rongen GA，de Boer RA，et al. The cardioprotective effects of metformin[J]. Current Opinion in Lipidology，2011，22（6）：445-453.

[12] di Mari JF，Davis R，Safirstein RL. MAPK activation determines renal epithelial cell survival during oxidative injury [J]. Am J Physiol，1999，277（2 Pt 2）：F195-F203.

[13] Lin A，Sekhon C，Sekhon B，et al. Attenuation of Ischemia- Reperfusion Injury in a Canine Model of Autologous Renal Transplantation [J]. Transplantation，2004，78（5）：654-659.

[14] de Oliveira CP，Stefano JT，de Siqueira ER，et al. Combination of N-acetylcysteine and metformin improves histological steatosis and fibrosis in patients with non-alcoholic steatohepatitis [J]. Hepatol Res，2008，38（2）：159-165.

[15] Xiao H，Ma X，Feng W，et al. Metformin attenuates cardiac fibrosis by inhibiting the TGFbeta1-Smad3 signalling pathway [J]. Cardiovasc Res，2010，87（3）：504-513.

[16] Gueler F，Gwinner W，Schwarz A，et al. Long-term effects of acute ischemia and reperfusion injury [J]. Kidney Int，2004，66（2）：523-527.

[17] de Oliveira CP，Stefano JT，de Siqueira ER，et al. Combination of N-acetylcysteine and metformin improves histological steatosis and fibrosis in patients with non-alcoholic steatohepatitis [J]. Hepatol Res，2008，38（2）：159-165.

[18] Sahra IB，Laurent K，Loubat A，et al. The antidiabetic drug metformin exerts an antitumoral effect in vitro and in vivo through a decrease of cyclin D1 level [J]. Oncogene，2008，27（25）：3576-3586.

[19] Zakikhani M，Dowling R，Fabtus IG，et al. Metformin is an AMP kinase-dependent growth inhibitor for breast cancer cells [J]. Cancer Res，2006，66（21）：10 269-10 273.

[20] Cantrell LA，Zhou C，Mendivil A，et al. Metformin is a potent inhibitor of endometrial cancer cell proliferation-implications for a novel treatment strategy [J]. Gynecol Oncol，2010，116（1）：92-98.

[21] Oh CJ，Kim JY，Choi YK，et al. Dimethylfumarate attenuates renal fibrosis via NF-E2-related factor 2-mediated inhibition of transforming growth factor-beta/Smad signaling [J]. PLoS One，2012，7（10）：e45870.