丹参注射液对大鼠下颌骨骨折愈合过程中BMP—2和TGF—β1的影响

向乐 余伟

[摘要] 目的 探讨丹参注射液对大鼠下颌骨骨折愈合的影响，并通过测量骨形成蛋白-2（BMP-2）、转化生长因子-β1（TGF-β1）水平变化，探讨丹参促进下颌骨骨折愈合的機制。 方法 选取SD大鼠48只，通过双侧下颌骨体部造成颊舌侧贯穿不完全性骨折模型，按随机数字表法分为实验组和对照组，每组24只。实验组每天腹腔注射丹参注射液（1 mL/kg），对照组每天腹腔注射生理盐水。术后第1、2、3、4周，每组分别随机处死6只大鼠，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清BMP-2、TGF-β1的含量。取出双侧下颌骨，右侧下颌骨行X线片检测骨折愈合情况并测量骨痂区的平均骨密度，标本经组织脱钙、石蜡包埋行HE染色后，采用骨组织形态计量学方法分析骨痂区骨小梁面积比、骨小梁宽度；左侧下颌骨骨痂，行组织粉碎，采用RT-qPCR技术检测BMP-2、TGF-β1的表达情况。 结果 X线结果显示对照组骨折愈合明显延迟于实验组；从第2周开始，与对照组相比，实验组骨痂骨密度明显增加（P < 0.05或P < 0.01），骨痂区骨小梁面积比、骨小梁宽度显著性增大（P < 0.05或P < 0.01）；差异随着愈合时间的延长而显著。ELISA结果显示，术后实验组血清BMP-2、TGF-β1的浓度均高于对照组（P < 0.05）。RT-qPCR结果显示，术后第2周开始，实验组骨痂中BMP-2及TGF-β1mRNA的表达均高于对照组（P < 0.01）。 结论 丹参注射液促进下颌骨骨折愈合，可能与促进骨折愈合过程中BMP-2、TGF-β1基因的转录及蛋白表达有关。

[关键词] 丹参注射液；下颌骨骨折；骨形成蛋白-2；转化生长因子-β1

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）08（a）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of Danshen Injection on mandibular fracture of healing in rat and observe the changes of bone morphogenetic protein-2（BMP-2）， transforming growth factor-β1（TGF-β1）. Methods Forty-eight SD rats were operated for incomplete fracture of hibateral mandible penetrated from buccal side to lingual side. The rats were divided into experimental group and control group according to random number table， with 24 rats in each group. The experiment group was administered with Danshen Injection by intraperitoneal injection， and the control group was administered with physiologic saline by intraperitoneal injection. The right healing of fracture were used to detect fracture healing by X-ray and to measure the average bone density of the callus area， the percent trabecular and trabecular width were analyzed by bone histomorphometry and the serum levels of BMP-2， TGF-β1 was determined by ELISA at 1， 2， 3， 4 weeks after the operation. The right healing of fracture were comminuted， and the expression of BMP-2 and TGF-β1 were analyzed by RT-qPCR. Results The X-ray results showed that the fracture healing in the control group was obviously delayed in the experimental group. After 2 weeks， compared with the control group， the callus bone mineral density （BMD） in the experimental group was increased （P < 0.05 or P < 0.01）. The trabecular area ratio and trabecular width in the callus area were markedly increased （P < 0.05 or P < 0.01）， and the difference was even more increased along with the increasing time. ELISA results showed the serum levels of BMP-2 and TGF-β1 in the experimental group were higher than those in the control group （P < 0.05）. RT-qPCR results showed the expression of BMP-2 and TGF-β1 in the experimental group were higher than those in the control group from the 2nd week after operation （P < 0.01）. Conclusion Danshen Injection can promote the healing of mandibular fracture， which may be related to the transcription and protein expression of BMP-2 and TGF-β1 gene during the process of fracture healing.

[Key words] Danshen Injection； Mandibular fracture； Bone morphogenetic protein-2； Transforming growth factor-β1

下颌骨位于颜面下部，是颌面部体积最大且位置较为突出的骨骼。由于其解剖位置特殊，容易遭受外力而受损伤，据统计下颌骨骨折发生率占颌骨骨折的50%～70%[1]。下颌骨骨折愈合过程又较为复杂，受诸多因素的影响[2]，如饮食、年龄、损伤程度等。如何加快下颌骨骨折愈合成为口腔颌面外科医生关注的焦点。近年来，随着医学的发展，研究人员对下颌骨骨折愈合机制的认识不断拓展，中医药治疗下颌骨骨折取得了良好的效果。

丹参具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦之功效，是一味重要的中药。前期研究表明，丹参能扩张血管、增加血流量，改善骨折处局部微循环[3-4]；促进成骨细胞增殖、分化[5-6]、同时抑制破骨细胞活性[7-8]。本研究基于前人理论，选用丹参注射液观察其对大鼠下颌骨骨折愈合的影响，并探讨其在下颌骨骨折愈合过程中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级SD大鼠48只，体重（250±50）g，由湖北省实验动物研究中心提供，许可证号：SCXK（鄂）2008-00051。大鼠自由饮水进食，标准普通饲料喂养。饲养于湖北医药学院动物实验中心清洁动物房，室温23～25℃，相对湿度50%～70%。

1.2 试剂与器械

丹参注射液（四川升和药业股份有限公司，生产批号：160523），骨形成蛋白-2（BMP-2）及转化生长因子-β1（TGF-β1）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（重庆鼎国生物有限公司，生产批号均为201608），数字X线平片机（SIEMENS，德国），KDIS影像处理软件，RM2235型石蜡切片机（Leica，德国），ABI7500型PCR仪，低速离心机（TD6M，高科仪器）。

1.3 方法

1.3.1双侧下颌骨骨折的建立 大鼠通过手术建立双侧下颌骨骨折模型[9]，10%水合氯醛以3 mL/kg剂量进行大鼠腹腔麻醉后，剪去大鼠两侧下颌区及颈上部毛，暴露下颌体下缘及其颊舌侧面，以下颌第三磨牙后对应的下颌骨下缘为定点，髁状突顶点与定点，用低速手機（1500 r/s）制造宽1 mm，深3 mm的颊舌侧贯通的不完全离断性骨折模型。术中不断用生理盐水冲洗、冷却，术后将皮肤、皮下组织分层缝合。并与术后当日给予青霉素抗感染（1 mol/L，20 U/d），连续3 d。

1.3.2 动物分组 48只大鼠按随机数字表法分为实验组和对照组，每组24只，常规饮食。在造模3 d后，实验组每天腹腔注射丹参注射液（1 mL/kg），对照组每天腹腔注射等计量生理盐水。

1.3.3 血清BMP-2、TGF-β1测定 术后第1、2、3、4周时，用水合氯醛麻醉大鼠，心脏取血，4℃静置4 h，离心机转速4000 r/min，离心半径10 cm，离心10 min后，提取血清，检测BMP-2、TGF-β1含量。

1.3.4 X线检查及骨痂区骨密度检测 术后第1、2、3、4周时，取右侧下颌骨标本，于X线机下拍摄正位片，观察骨折愈合程度；用KDIS影像处理软件对骨痂区行骨密度检测，计算出骨痂区的平均骨密度值。

1.3.5 骨痂区组织形态计量学测定 将X线检查后骨痂标本置于4%的多聚甲醛液中固定（48 h），PBS冲洗，然后在4℃下用EDTA溶液脱钙，可以用大针头轻轻刺进去者即脱钙完全[10]。石蜡包埋后切4 μm薄片，HE染色。术后每个周期，两组选取6张切片，每个切片选择3个视野，每组共18个视野，采用Image-Pro Plus 6.0图像测量与分析系统进行骨组织形态学指标（骨小梁面积百分比、骨小梁宽度）的测量[9]。

1.3.6 总RNA的提取及逆转录 按吕桂浩等[11]的方法，各组动物分批处死同时迅速取左侧下颌骨骨折处100 mg骨痂组织，液氮速冻、保存，并提取骨痂组织总RNA。引物由上海生工涉及、合成，引物序列见表1。按PrineScript RT reagent kit with gDNA Eraser试剂盒说明书进行RT-PCR，扩增反应采用20 μL体系：SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RnaseH Plus） 10 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，cDNA 2 μL，dH2O 6 μL。循环参数：模板cDNA 95℃预变性30 s后进行循环。变性95℃ 5 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，共进行40个循环。反应结束后，采用Delta-delta Ct法计算目的基因表达变化[12]。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 X线检查

骨折后，各时间点的X线检查结果见图1。术后1周时各组下颌骨骨折线较为明显；术后2、3周时，实验组骨折线开始变模糊，对照组骨折线较实验组清晰；术后第4周时，实验组骨折线显影与周围组织十分相近，界限不太清晰，对照组的骨折线仍然比较明显。

2.2 骨密度检测

随着实验进行，两组骨痂组织的BMD逐渐增加。从术后第2周开始，与对照组比较，骨折后各时间点实验组骨痂BMD明显高于对照组（P < 0.05或P < 0.01）。见图2。

2.3 骨痂区组织形态计量学

随着实验进行，两组骨痂区各识相点骨小梁的面积比、骨小梁的宽度逐渐增加。从术后第2周开始，与对照组比较，实验组骨痂区在各时相点骨小梁的面积比、骨小梁的宽度均高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见图3。

2.4 两组大鼠血清BMP-2、TGF-β1变化情况

与对照组比较，实验组各时相点浓度较高（P < 0.05或P < 0.01），且在术后第3周时，实验组中血清BMP-2、TGF-β1浓度达到峰值，之后血清BMP-2、TGF-β1浓度开始下降。见图4。

2.5 两组大鼠BMP-2 mRNA、TGF-β1 mRNA变化情况

从术后第2周开始，与对照组比较，实验组各时间点BMP-2 mRNA、TGF-β1mRNA表达量均高于对照组，差异有高度统计学意义（P < 0.01），术后第3周时，实验组BMP-2 mRNA、TGF-β1 mRNA表达量最高，之后BMP-2 mRNA、TGF-β1 mRNA的表达开始下降。见图5。

3讨论

下颌骨骨折是口腔颌面外科常见的疾病，并且以男性多见，而交通事故在致伤原因中居于首位[13]。目前，下颌骨骨折治疗临床应用较多的是坚强内固定（RIF）技术，虽然具有一定的效果，但是容易造成患者咬合关系紊乱及颌面部畸形[14]。研究表明，骨折的愈合是一个复杂的组织学、生物学、内分泌学及生物力学的动态过程，按组织学变化分为3个阶段：血肿机化期、原始骨痂形成期、骨痂改造塑形期[15]。每个过程都有明显的组织学和生理学特征，该过程是各种因素相互协同、相互拮抗的结果[16]。

丹参性味苦，归心、肝经，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消肿之功效。丹参以其疗效确切、副作用小，被广泛应用与临床各类疾病[17-20]。前期研究表明，丹参具有扩张血管、增加血流量，改善骨折处局部微循环[21]，故丹参对骨折愈合的作用是肯定的。但是丹参在下颌骨愈合过程中分子作用机制尚不清楚。

骨力学强度和骨密度有很大相关性，体现了骨组织的密度。所以，骨折愈合的程度主要表现在骨密度的变化[16]。本实验X线片发现，对照组骨折愈合明显延迟于实验组，实验组的BMD值增加明显高于对照组，并且随着时间的变化，差异更加显著。骨小梁的面积比反映骨量的多少，是评价骨量变化的重要指标；骨小梁的宽度反映骨小梁形态结构，解释骨量变化[22]。组织形态计量学显示，从术后第2周开始，实验组明骨痂区骨小梁的面积比，骨小梁的宽度明显提高，提示丹参能够促进骨痂区骨小梁的形成，增加骨折区骨量，这与X线片观察结果一致。

大量实验研究表明，BMP-2及TGF-β1在骨折愈合過重中发挥重要的作用。BMP-2属于TGF-β超家族成员。在早期发育期间，BMP-2与其BMPs受体结合，诱导间充质干细胞分化成软骨细胞和成骨细胞，参与骨及软骨发育，促进骨组织生长、发育及骨折愈合[23-24]。此外，BMP-2还有促进血管再生[25]。TGF-β1可刺激间充质干细胞增殖、分化，诱导间充质干细胞分化成成骨细胞[26]及软骨细胞[27]，促进骨生成及软骨修复。同时，在血肿机化期，血小板释放TGF-β1能刺激骨膜生发层细胞使其增殖[28]。ELISA结果显示：实验组各时间点血清BMP-2、TGF-β1浓度均高于对照组。其中实验组血清BMP-2、TGF-β1的浓度在第1～3周逐渐增加，并在第3周达到峰值，之后逐渐下降；对照组血清BMP-2、TGF-β1的浓度在术后第2周达到峰值，之后逐渐下降。PCR结果显示：从术后第2周开始，各时间点实验组BMP-2 mRNA、TGF-β1 mRNA的表达量明显高于对照组，并且在术后第3周时，BMP-2 mRNA、TGF-β1 mRNA表达量最高，之后逐渐下降；对照组中BMP-2 mRNA、TGF-β1 mRNA表达量在术后第2周时最高，之后逐渐下降。提示丹参不仅能增加BMP-2、TGF-β1基因转录及蛋白表达，而且还能延长其表达峰值时间，在骨折愈合过程中BMP-2、TGF-β1可能存在相互作用。

本实验通过研究丹参注射液对大鼠下颌骨骨折影响，并测定了BMP-2、TGF-β1血清浓度及骨痂组织中mRNA的变化，提示丹参能够促进大鼠下颌骨骨折愈合，可能与丹参促进BMP-2、TGF-β1基因转录及蛋白表达有关，从而为丹参促进下颌骨骨折愈合的机制提供佐证。值得注意的是，骨折愈合是一个复杂的过程，需要多种骨生长因子共同参与、协调才能完成。在后期的实验中将进一步通过分子生物学实验研究丹参促进下颌骨骨折愈合的机制，为丹参在临床中更好应用提供理论依据。

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