miR-1290通过抑制干扰素调节因子-2调控非小细胞肺癌的增殖

肺癌是世界范围内发病率最高的恶性肿瘤之一，由肺癌所导致的死亡率居各种癌因死亡的首位［1］。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占肺癌的80%［2］，尽管近年来对NSCLC的研究取得了大量的进展，但是其高复发性和易转移性的特点导致NSCLC预后依然较差。因此，探讨NSCLC的增殖和转移的发病机制，对改善患者预后具有重要的临床意义。微小RNA（microRNA，miRNA）是由22个核苷酸组成的非编码RNA分子，在细胞的增殖、分化、凋亡和肿瘤形成中发挥关键作用［3］。miR-1290已被证实在多种恶性肿瘤中表达异常，并参与了肿瘤的增殖、侵袭和转移等多种生物学过程。如在喉鳞状细胞癌中，miR-1290通过下调靶向基因MAF、ITPR2表达促进肿瘤进展［4］。在肺癌组织中，miR-1290表达上调，并与肿瘤的临床分期和远处转移相关［5］。虽然已经发现NSCLC与miR-1290表达有关，但是其在NSCLC中的作用及相关机制仍鲜见报道。本研究通过检测NSCLC癌组织及癌旁组织miR-1290表达，分析miR-1290表达与病理参数的关系；并进一步利用体外细胞实验，干预或过表达NSCLC细胞miR-1290表达水平，探讨miR-1290在NSCLC增殖和侵袭中的作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 病例资料

收集2014年6月至2017年6月成都市双流区第一人民医院行手术治疗的41例NSCLC患者癌组织及距肿瘤切缘2 cm以上的癌旁组织（镜下观察未见癌细胞），样本取出后立即置于液氮中保存。纳入标准：病理学证实为NSCLC；术前未接受放疗、化疗或其他抗癌治疗；患者临床资料完整。排除标准：合并其他恶性肿瘤；除NSCLC外的其他慢性消耗性疾病。本研究经医院伦理委员会批准；所有患者均签署知情同意书。

1.2 细胞来源与培养

肺癌细胞系A549和H460以及正常支气管上皮细胞BEAS-2B均购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。上述细胞均接种于RPMI 1640培养基（含100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素和10%胎牛血清），置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.3 试剂

RPMI 1640培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；Lipofectamine 2000、TRIzol试剂、PrimeScript逆试剂盒、PrimeScript RT Master Mix购自美国Invitrogen公司；IRF2抗体购自美国Novus公司；二抗购自北京中山金桥生物技术有限公司；β-actin抗体购自美国Santa公司；发光液、PVDF膜、BCA蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司；miR-1290 mimic、miR-1290 inhibit及其阴性对照组均购自广州市锐博生物科技有限公司；IRF2 3′UTR质粒购自美国Invitrogen公司；Dual-Luciferase reporter assay购自美国Promega公司；Transwell小室购自美国BD公司；CCK8试剂、miR-1290探针、U6探针均购自日本TARAKA公司；荧光定量PCR仪7500型购自美国应用生物系统公司。

1.3 实验方法

1.3.1 RNA提取与实时荧光定量法检测 TRIzol试剂提取组织和细胞中RNA，按照PrimeScript试剂说明书逆转录为cDNA，检测miR-1290及IRF2表达。反应条件：95℃ 30 s，95℃ 15 s，60℃30 s，40个循环。反应结束后获得溶解曲线和扩增曲线。miR-1290相对表达量以U6作为内参照，miR-1290上游引物：5′-GGCTCTGA GTGGTTGAGC-3′；下游：5′-CAGTGCGTGTCGTGGA GT-3′。U6上游引物：5′-GCTTGCGCACGAGATATA GTAA zAAT-3′；下游：5′-CCGTTGAGCAATTTGCCTGT GAT-3′。IRF2相对表达量以β-actin作为内参照，IRF2上游引物：5′-TGAACTGCATACTACGCTCAAGA-3′；下游：5′-CGGATTCGTCACAATGTGTTC-3′。β-actin上游引物：5′-TGGCCCCAGCACAATGAA-3′；下游：5′-CTAA GAGATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。反应结束后计算每个基因的循环阈值（Ct），并与β-actin或U6比较，确定目的基因相对表达水平。

1.3.2 Western blot检测IRF2蛋白 利用Western blot检测IRF2蛋白表达，取肿瘤组织和癌旁组织，剪碎后匀浆，加入裂解液200µL裂解约30 min后，低温离心（12 000 rpm，4℃ 10 mins），吸取上清液分装。测定蛋白质浓度，配置8%SDS-PAGE分离胶、5%SDSPAGE积层胶，取10µL样品上样，80v-120v电压下进行电泳。转膜后加入一抗，4℃过夜。加入二抗（1:5 000稀释）后，37℃摇床中孵育1.5 h，进行发光显影扫描记录数据。

1.3.3 细胞转染 将A549和H460细胞接种于6孔板，培养24 h，待细胞融合接近70%进行转染。分别设置miR-1290 mimic组、miR-1290 inhibit组和阴性对照组（miR-1290 NC）。按照试剂盒说明书，将Lipofectamine 2000与miR-1290 mimic或miR-1290 inhib-it或miR-1290 NC混合，使之终浓度为100 nmol/L，加入各组细胞中，室温孵育6 h后更换完全培养基。

1.3.4 细胞增殖与克隆形成实验 细胞增殖实验：采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力，将转染的细胞接种于96孔板，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。检测前2 h向每孔中加入10µL CCK-8试剂（5 mg/mL）；分别于培养24、48、72、96 h后采用酶标仪检测450 nm处光密度值（OD值）。

平板克隆形成实验：细胞接种于12孔板，37℃、5%CO2培养箱中培养14d，甲醇固定，1.0%结晶紫染色15min，显微镜下观察克隆细胞数。

13.5 细胞侵袭实验 使用50 mg/L的Matrigel稀释液包被小室底部膜的上室面，4℃风干后，用浓度为10 g/L BSA的无血清培养液于37℃下水化30 min。按照试剂盒说明书，将转染后的各组细胞接种于Transwell上室，上室终体积为200µL，下室终体积为800µL，细胞继续培养48 h，甲醇固定20 min，0.1%结晶紫染色15 min，PBS冲洗3遍，棉签轻轻擦去内层细胞，显微镜下观察细胞侵袭的数量。

1.3.6 双荧光素酶报告基因实验 利用TargetScan和miRanda在线分析软件预测miR-1290的靶向基因。选取可以与miR-1290结合的IRF2 3′-UTR序列，并插入pGL3-Control质粒，构建IRF2 3′-UTR序列的荧光素酶报告基因质粒（3′UTR IRF2-WT）和含有IRF2 3′-UTR突变序列的荧光素酶报告基因质粒（3′UTR IRF2-MUT），质粒的构建由美国Invitrogen公司完成。利用Lipofectamine 2000使A549细胞共转染miR-1290 mimic、miR-1290 NC以及野生型3′UTR IRF2或突变型IRF2 3′-UTR，转染6 h后更换RPMI-164完全培养基，60 h后裂解的细胞行双荧光素酶报告基因，以海肾质粒的荧光值作为内参照。

1.4 统计学分析

采用SPSS 22.0软件包进行统计学分析。计量资料采用表示，两组间比较采用t检验。采用Spearman′s相关分析NSCLC组织miR-1290表达与IRF2的关系。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-1290在NSCLC组织和细胞的表达

癌组织miR-1290相对表达量明显高于癌旁组织（图1A），A549、H460细胞miR-1290表达明显高于BEAS-2B细胞（图1B），癌组织IRF2 mRNA相对表达量明显低于癌旁组织（图1C），两组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。相关性分析显示，NSCLC组织miR-1290表达与IRF2 mRNA表达呈负相关（P＜0.05，图1D），癌组织IRF2蛋白表达量明显低于癌旁组织（图1E），两组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。NSCLC组织miR-1290表达与IRF2蛋白表达呈显著负相关（P＜0.05，图1F）。miR-1290表达与NSCLC患者性别、年龄分化程度、肿瘤直径无关（P＞0.05），淋巴结转移者miR-1290表达明显高于无淋巴结转移者，Ⅲ/Ⅳ期患者miR-1290表达明显高于Ⅰ/Ⅱ期，差异具有统计学意义（P＜0.05，表1）。

2.2 miR-1290对A549和H460细胞增殖的影响

CCK-8实验显示，转染miR-1290 mimic的A549和H460细胞在培养72、96 h后，细胞增殖能力明显高于阴性对照组，转染miR-1290 inhibit的A549和H460细胞细胞增殖能力明显低于阴性对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05，图2A，B）。克隆形成实验显示，A549和H460细胞中miR-1290 mimic组细胞克隆数明显高于miR-1290 NC组，miR-1290 inhibit组克隆数明显低于miR-1290 NC组，差异具有统计学意义（P＜0.05，图2C，D）。

表1 miR-1290表达与NSCLC患者临床资料的关系

2.3 miR-1290对A549和H460细胞侵袭的影响

细胞侵袭实验显示，在A549和H460细胞中，miR-1290 mimic组侵袭细胞数明显高于miR-1290 NC组，miR-1290 inhibit组侵袭细胞数明显低于miR-1290 NC组，差异具有统计学意义（P＜0.05，图3）。

2.4 双荧光素酶报告基因实验检测miR-1290与IRF2 3′-UTR的结合情况

在A549细胞共转染miR-1290 mimic、miR-1290 NC以及3′UTR IRF2-WT和3′UTR IRF2-MUT后，3′UTR IRF2-WT细胞中miR-1290 mimic组荧光值明显低于miR-1290 NC组（P＜0.05），而3′UTR IRF2-MUT细胞中miR-1290 mimic组荧光值与miR-1290 NC组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图4A。

2.5 miR-1290对A549和H460细胞IRF2表达的影响

在A549和H460细胞中，miR-1290 mimic组IRF2 mRNA相对表达量明显低于miR-1290 NC组，miR-1290 inhibit组IRF2 mRNA相对表达量明显高于miR-1290 NC组，差异具有统计学意义（P＜0.05，图4B）。

图1 miR-1290在NSCLC组织和细胞中的表达

图2 miR-1290对A549和H460细胞增殖的影响

图3 miR-1290对A549和H460细胞侵袭的影响（Transwell染色×200）

图4 miR-1290对IRF2表达的影响

3 讨论

miRNAs是由约22个核苷酸组成的非编码小分子RNA，通过抑制转录水平调控相关基因的表达。大量证据显示［6-7］，miRNAs在多种疾病特别是恶性肿瘤的发生和进展中发挥关键作用。肿瘤异常表达的miRNAs为治疗提供了潜在的靶点，基于miRNAs的治疗也被认为是治疗恶性肿瘤的有效手段之一。miR-1290是最新发现的miRNAs，在多种实体瘤中异常表达，并参与肿瘤的进展和远处转移［8］。邱庆崇等［9］报道称miR-1290在直肠癌患者血浆中表达上调，且高miR-1290表达与直肠癌分期和远处转移有关。Tsang等［10］认为miR-1290可能与胃癌化疗敏感型和雌激素受体阳性乳腺癌的生物学行为密切相关。Bu等［11］证实miR-1290可能会损害细胞质分裂，并影响结肠癌细胞的重编码。

在肺癌方面，体外研究证实［12］，miR-1290通过抑制A549细胞Bcl-2蛋白表达阻断积雪草酸诱导的细胞凋亡，并促进肿瘤的增殖。Kim等［13］称小细胞肺癌患者血浆miR-1290表达上调，高miR-1290表达也是影响患者远期生存的危险因素。本研究显示，与癌旁组织比较，NSCLC组织miR-1290表达明显上调；体外细胞实验也发现A549、H460细胞miR-1290表达明显高于BEAS-2B细胞。提示miR-1290可能在NSCLC的发生和进展中发挥类似“癌基因”的作用。进一步观察miR-1290表达与NSCLC患者临床病理资料的关系，发现miR-1290表达与淋巴结转移、高TNM分期有关，提示miR-1290亦有可能为NSCLC的转移和病情评估提供依据。

肿瘤是细胞增殖和侵袭均异常的疾病，过度增殖在肿瘤的发生和进展中起到重要作用。Jin等［14］报道miR-1290参与了肿瘤细胞的上皮间充质转化（EMT）过程，并促进细胞的增殖、迁移。国外最新研究显示［15］，miR-1290可能通过与K-Ras的3′-UTR结合，并激活下游ERK信号通路，从而促进肿瘤细胞的EMT，增强肿瘤细胞的侵袭、转移。本研究利用细胞转染技术，分别将miR-1290 mimic和miR-1290 inhibit转染至H460和A549细胞内，结果发现高表达miR-1290可以促进细胞的增殖和克隆形成，而抑制miR-1290表达则出现相反的现象，说明miR-1290可能通过促进细胞增殖参与NSCLC的形成。本研究进一步检测了miR-1290对肺癌细胞株侵袭的影响，结果显示miR-1290 mimic组侵袭细胞数明显高于miR-1290 NC组，而miR-1290 inhibit组侵袭细胞数明显低于miR-1290 NC组，证实miR-1290可能与NSCLC的进展有关。

研究发现［16］，干扰素调节因子-2在多种恶性肿瘤中发挥类似“抑癌基因”的作用。如在胃癌中，IRF2是miR-520c的下游靶基因，miR-520c通过抑制IRF2表达促进胃癌细胞的增殖、转移和侵袭［17］。Liu等［18］发现在肺癌细胞中，上调miR-450表达可以激活IRF2并抑制细胞的增殖。Liang等［19］也证实IRF2可能是microRNA-18a-5p靶向基因，两者相互作用共同调节肺癌的发生和进展。综合目前的报道，miR-1290可能通过调控不同的靶蛋白发挥不同的生物学功能，其中有部分报道提及IRF2可能是miR-1290新的靶基因［20-21］。本研究首选观察了NSCLC癌组织和癌旁组织IRF2表达，结果显示NSLCL癌组织IRF2 mRNA和蛋白相对表达量均明显低于癌旁组织，相关性分析也证实NSCLC组织miR-1290表达与IRF2表达呈负相关，说明miR-1290高表达和IRF2低表达共同参与了NSCLC的形成、进展。本研究进一步利用双荧光素酶报告基因实验验证肺癌细胞中miR-1290和IRF2的关系，结果显示miR-1290可以与IRF2 3′-UTR结合，抑制IRF2信号通路的活性。说明在NSCLC中，IRF2可能是miR-1290的调控靶基因之一。此外qPCR也证实高表达miR-1290可以抑制IRF2，而抑制miR-1290可以促进IRF2表达，进一步证实了上述结论。

综上所述，miR-1290在NSCLC组织和细胞中高表达，miR-1290可能通过与IRF2结合，促进肿瘤细胞的增殖和侵袭。本研究仅观察了miR-1290与IRF2的关系，两者之间的相关信号通路以及是否有其他靶基因参与仍需要进一步证实。