趋化因子CXCL5在肾癌中的表达及临床意义

冯国伟 李宏蕾 朱大帅 张艳辉 宋鸽 张振庭 陈明 杜君 姚欣

肾癌是常见的恶性肿瘤，发病率位居女性泌尿系统恶性肿瘤第一位，位居男性第三位［1］。高达40%患者最终发生转移［2］，30%患者在初诊时被诊断为转移性肾癌。肾癌对化疗和放疗不敏感，对分子靶向治疗反应率低，5年生存率＜10%［3］。因此，深入理解肾癌的发病机制，寻求新的可靠的肿瘤预测因子，将为改善早期诊治提供重要帮助。研究显示，趋化因子参与构建肿瘤微环境，并在肿瘤增殖、侵袭、进展和转移等多种生物学过程中发挥重要作用［4］。新的证据提示，趋化因子配体5（CXCL5）在膀胱癌［5］、前列腺癌［6］等恶性肿瘤中高表达，通过增强细胞增殖和迁移而促进肿瘤转移。但是，CXCL5在肾癌发生发展中的作用尚不清楚，其对于肿瘤进展的预测作用仍有待阐述。本研究通过整理数据库和肾癌患者的临床病理资料，评价CXCL5在肿瘤中的表达，考察其表达水平与临床分期、病理分级、肿瘤侵袭和转移以及预后的相关性，旨在阐述CXCL5的表达与临床意义的关系，为肾癌的早期诊断和精准治疗提供新的思路和证据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例资料 收集2012年11月至2014年6月105例就诊于天津医科大学肿瘤医院并行手术治疗的肾癌患者的临床病理资料，62例组织标本中CXCL5表达的患者作为试验组，选择正常肾脏和癌旁组织标本各20例作为对照组。根据CXCL5的表达情况将试验组62例分为低表达组26例、中表达组20例、高表达组16例。采用Fuhrman分级系统进行分级，试验组FuhrmanⅠ级、Ⅱ级、Ⅲ～Ⅳ级组织中CXCL5表达标本各20、20、15例，对照组的正常肾脏、癌旁组织中CXCL5表达标本各3、7例。本研究经医院伦理委员会批准。

1.1.2 试剂 兔源抗人CXCL5单克隆抗体购自英国Abcam公司，兔SP试剂盒购自北京中杉天桥生物技术有限公司。TRIzol试剂盒购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自美国Promega公司。快速荧光定量PCR试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 CbioPortal数据库 整合包括TCGA、ICGC等数据库中126个肿瘤基因组研究。检索数据库中肾癌患者的CXCL5变异/突变情况，筛选出样本量较多和信息量较大的研究项目，获得详细的突变结果。此外，从TCGA数据库中筛选出与CXCL5突变相关的临床预后信息（如总生存率、无病生存率以及肿瘤转移等）并对数据进行分析。

1.2.2 免疫组织化学法检测 采用免疫组织化学法检测病理切片中CXCL5的表达，实验步骤按照试剂说明书进行。采用双盲法，由两位资深病理医师分别阅片评判。在显微镜下随机选取10个视野，评估阳性细胞在整个视野中所占百分比，计算平均值。其中阳性细胞百分比＜25%为低表达组，阳性细胞百分比25%～75%为中表达组，阳性细胞百分比＞75%为高表达组。CXCL5表达的定量分析根据阳性区域在每一个视野中所占面积设计评分系统：0分（0）、1分（1%～25%），2分（26%～50%），3分（51%～75%），4分（76%～100%）。

1.2.3 实时定量RT-PCR检测 研磨肾癌组织样本，TRIzol法提取总RNA，使用Nanodrop分光光度计进行RNA定量。使用逆转录试剂盒进行cDNA合成。选取GAPDH作为内参，定量分析目的基因mRNA水平。每个样本3个复孔，每个实验重复3次。

1.2.4 随访 截至2018年5月，术后随访时间为46～66个月，平均随访时间为54.9个月。总随访人数为105例，失访人数为12例。43例不表达CXCL5和62例表达CXCL5患者中，有效随访人数分别为40例和53例，死亡人数分别为11例和14例。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0和GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析及绘图。利用Spearsman和χ2检验进行相关性分析，利用Kaplan-Meier法进行生存分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 基于数据库的CXCL5与肾癌预后相关性分析

通过检索CbioPortal数据库发现，相较于CXCL5无突变的肾癌患者，CXCL5突变患者的总生存率（图1A）和无病生存率（图1B）均明显缩短（P＜0.05），而其复发的比例较高（66.67%vs.29.67%），中位无病生存时间较短（33.38个月vs.108.37个月）。此外，CXCL5 mRNA表达水平与M分期（图2A）、T分期（图2B）以及淋巴结浸润（图2C）有一定相关性，而且CXCL5的表达水平还与患者总生存状态（图2D）和生命状态（图2E）有关。

图1 CXCL5突变与肾癌患者总生存率和无病生存率的关系

2.2 CXCL5表达与肾癌病理分级、临床分期以及预后的关系

在高表达CXCL5的肾癌组织中，Fuhrman高分级（Ⅲ～Ⅳ级）的患者所占比例较大，且在不同Fuhrman分级的肾癌组织中CXCL5的表达差异具有统计学意义（P＜0.05）。此外，CXCL5的表达与肿瘤大小呈正相关，与此对应的CXCL5高表达组中，T3期患者所占比例较大（P＜0.05，表1）。

不表达与表达CXCL5患者的1、2、3和5年生存率分别为96%、92%、87%和79%与93%、85%、76%和65%，Kaplan-Meier生存分析发现不表达和表达CXCL5患者之间差异具有统计学意义（P＜0.05，图3），提示表达CXCL5的肾癌患者预后较差。

2.3 肾癌组织中CXCL5的表达

免疫组织化学法检测对照组的正常肾脏组织中CXCL5表达率为15.00%（3/20）、癌旁组织中为35.00%（7/20），试验组为59.05%（62/105），组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05，图4A）。CXCL5表达定量分析的评分结果显示，对照组的正常肾脏组织中CXCL5表达为（0.13±0.06）分、癌旁组织中为（0.64±0.32）分，试验组中FuhrmanⅠ级为（0.99±0.40）分、Ⅱ级为（1.57±0.42）分、Ⅲ～Ⅳ级为（2.87±0.46）分，试验组的评分显著高于对照组（P＜0.05，图4B）。同时，本研究随机选取50例肾癌患者的组织标本，检测CXCL5 mRNA表达水平，其中39例（78%）上调表达、8例（16%）不表达、3例（6%）下调表达（图5A）。此外，试验组的CXCL5表达显著高于对照组（P＜0.05），且随Fuhrman分级增加呈现增加趋势（图5B）。

图2 CXCL5表达水平与肾癌患者的肿瘤转移、分期、阳性淋巴结数量及生存的关系

表1 CXCL5的表达与62例肾癌患者临床病理特征的关系

图3 CXCL5表达与肾癌患者生存率的关系

图4 免疫组织化学法检测试验组与对照组组织中CXCL5的表达

图5 实时定量RT-PCR检测CXCL5 mRNA的表达

3 讨论

CXCL5是ELR+CXC类趋化因子，又称上皮中性粒细胞活化肽78（ENA78），可由上皮细胞、内皮细胞和免疫细胞分泌，其与CXCR2识别并结合，趋化肿瘤细胞的运动，促进血管新生，加快肿瘤生长和转移［7］。有研究显示，CXCL5在临床高分期的恶性黑色素瘤中呈高表达［8］。CXCL5能够增强甲状腺癌细胞的迁移和侵袭能力，而且CXCR2基因敲除细胞实验证明，CXCL5/CXCR2生物轴能够诱导肿瘤细胞发生EMT并促进远处转移［9］。同时，在鼻咽癌中也观察到相似的结果［10］，揭示该生物轴通过激活ERK/GSK-3β/Snail信号通路促进肿瘤的EMT过程。

目前，肾癌组织中CXCL5的表达及临床意义尚不清楚。研究显示，肾癌患者血清中CXCL5的表达高于健康人群，而且进展期患者术前血清中CXCL5水平高于早期患者［11］。本研究结果显示，正常肾脏和癌旁组织中CXCL5不表达或呈局灶性表达，而肾癌组织中CXCL5高表达，其表达水平与患者年龄、性别、肿瘤位置、吸烟史和BMI指数等临床参数无关，但与临床分期和肿瘤大小相关，提示CXCL5可能参与肿瘤的生长和增殖。本研究结果还显示，不同CXCL5表达水平的亚组间，未观察到CXCL5表达与N分期和M分期的相关性，但仍不能排除CXCL5在肿瘤浸润和转移中的作用。重要的是，本研究发现CXCL5的表达与Fuhrman分级呈正相关。Fuhrman分级系统是应用最广泛的肾癌的核分级系统，也是目前被广泛认同的肾癌预后判断的独立指标之一。Fuhrman分级系统有助于判断疾病进展和预后、复发和转移风险［12］，Fuhrman分级越高则患者的总生存率和癌症特定生存率明显降低。本研究结果也显示，CXCL5表达的患者生存率明显降低。这些发现提示CXCL5可能与肾癌的进展有关，并在预测患者预后方面具有潜在价值。

CXCL5对肾癌生长和转移的影响及机制仍有待明确。研究显示，CXCL5/CXCR2生物轴对于肾癌血管新生、肿瘤生长和转移具有促进作用［13］。动物实验结果显示，CXCL5能够趋化骨髓来源抑制性细胞向肾脏肿瘤归巢，CXCR2抗体联合抗PD-1治疗能够显著减少肿瘤重量并增加CD4+和CD8+T细胞的浸润［14］。在另一项研究中，肾癌细胞通过分泌CXCL5和IL-8，趋化中性粒细胞浸润至肺转移病灶中并发挥免疫屏障作用，导致肿瘤细胞的生长受到抑制［15］，提示CXCL5能够防止肿瘤发生远处转移。由此可见，趋化因子在肿瘤中的作用复杂多样，在不同的时间和空间环境中表现出较强的异质性。因此，需要更多的证据来揭示CXCL5在肾癌发生发展中的作用和机制，对于肿瘤治疗新靶点的开发具有重要价值。

本研究仍存在一定的局限性，首先，研究纳入的样本量相对较小，结论还需在更大样本的研究中进一步验证；其次，本研究为回顾性分析，存在一定的偏倚。因此，展望今后的研究方向，期望设计前瞻性临床研究，在术前、术后以及随访中的不同时间点检测患者血清中CXCL5的表达水平，考察其与临床和病理指标的关系，探索其在患者疾病进展和预后评价中的应用价值。

综上所述，结合数据库和本中心的数据发现，CXCL5的表达与肾癌患者的不良预后有关；同时，在肾癌中CXCL5高表达，其表达水平与病理分级和临床分期呈正相关，CXCL5的表达预示着较差的临床预后。因此，CXCL5有望成为评估肾癌进展和预后的潜在指标，对以靶向CXCL5为基础的治疗策略提供理论基础和研究思路。