90例结直肠癌中前列腺特异性膜抗原的表达研究

郑又文 马永琛 陈善稳 朱静 于妍斐 王鹏远 杨兴 陈国卫

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是最常见的消化道恶性肿瘤之一，近年来在全球范围内的发病率和死亡率呈明显上升趋势［1］。2015年中国癌症统计数据提示中国每年CRC新增患者约为21.57万例，位列恶性肿瘤的第5位，死亡患者约为19.1万例，位列恶性肿瘤死亡的第5位［2］。早期和进展期CRC的生存率有较大差异，Ⅰ期患者5年观察生存率约为74%，而Ⅳ期患者不足10%，CRC的精确分期判断至关重要。早期CRC可选择内镜下治疗，但是否存在淋巴结转移，是选择内镜或手术治疗的关键因素。对进展期病例进行手术切除，目前淋巴结清扫一般按D3进行，也有争议认为更大范围的淋巴清扫术后有更优的生存优势［3］，但合理选择病例是难题。肝和肺转移灶治疗方案的选择，与病灶的数量、大小、位置等密切相关。上述临床问题面临选择时，非常依赖准确的影像学检查。核医学葡萄糖代谢显像18FFDG/PET的推广，改善了CRC转移病灶的检测，但在特异性方面存在严重缺陷，较难区分CRC转移淋巴结及炎症。高特异性淋巴结转移病灶显像技术将有利于辅助精准分期并提高根治手术的成功率。

近年来前列腺特异性膜抗原（prostate-specific membrane antigen，PSMA）显像试剂的发展，成为核医学领域高特异性显像的突破性进展［4-6］。PSMA作为肿瘤特异性标志物，在正常组织的表达仅限于脑、肾脏及唾液腺等，并高度过表达于前列腺癌细胞及各类肿瘤新生血管［7-11］。基于小分子的靶向试剂可针对PSMA蛋白引导的显像核素于体内富集，以达到显像的目的［12-13］。该技术最初运用于前列腺癌的显像，目前已可实现高灵敏度、高特异性的转移病灶显像，辅助前列腺癌的早期分期、手术后复发病灶定位以及治疗的监控［5-7］。随着显像技术的日趋成熟以及临床转化研究的深入，该技术处于向多种肿瘤应用的拓展阶段［14］。目前PSMA显像已成功拓展至肾透明细胞癌，并表现出良好的应用前景，PSMA的样本覆盖率可高达90%［15］。CRC的相关研究尚未深入开展，目前仅有少数关于PSMA在CRC中表达的报道，结果表明CRC中存在高强度PSMA表达，约为75%～85%［11，16］。PSMA显像病例的个别报道，从一定程度支持了PSMA对CRC患者显像的可行性［17-21］。然而有关PSMA临床病理研究的样本量尚有不足，且研究未覆盖亚洲人种。关于PSMA表达与临床病理因素的关系尚不明确，且存在不同观点（如PSMA表达量与远处转移关系等）［11，16］。本文选取90 例中国 CRC患者样本对其PSMA表达情况与临床病理因素的关系进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 一般资料 实验所用CRC组织切片购于西安艾丽娜生物科技有限公司。完整病例资料由西安艾丽娜生物科技有限公司提供，患者共90例，其中男性56例，女性34例，年龄为28～91岁，平均年龄为（56.311±13.475）岁，全部病例均为手术治疗，未行术前放化疗及生物治疗。所有组织切片由专业病理医生根据世界卫生组织肿瘤分类及诊断标准（2006年第一版）进行组织学病理诊断，根据美国癌症联合委员会（AJCC）癌症分期手册第七版对CRC进行TNM分期。癌旁组织经病理验证为正常组织。本研究经北京大学第一医院生物医学研究伦理委员会审核通过［批号：（2018）科研第（15）号］。

1.1.2 主要试剂 兔抗人PSMA单克隆抗体购于美国Cell Signaling Technology公司；兔抗人CD31单克隆抗体购于英国Abcam公司。免疫组织化学试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。本研究选取CD31为定位参考。

1.2 方法

1.2.1 PSMA免疫组织化学染色 组织切片先于65℃烤片30 min，然后采用免疫组织化学方法（兔聚合物检测系统）染色。PSMA抗体稀释倍数为1:100，CD31抗体稀释倍数为1:300，3%过氧化氢作用时间为15 min，2%羊血清封闭非特异性抗体45 min，第二抗体孵育时间30 min，其他按照试剂说明书进行操作。

1.2.2 结果判断 PSMA和CD31阳性染色表现为淡黄色或者棕黄色染色，而PSMA表达强度的判断方法为：显微镜下观察组织切片上每个小块（180个组织小块集成于一张组织切片上）的所有区域，判定染色颜色及染色血管的比例。染色评分采用文献报道的类似方法［11，16］。0分：无任何血管染色；1分：染色为淡黄色，染色血管比例≤10%；2分：染色为淡黄色，染色血管比例11%～50%或者染色为棕黄色，染色血管比例≤25%；3分：染色为淡黄色，染色血管比例51%～100%或者染色为棕黄色，染色血管比例26%～100%。

1.3 统计学分析

应用SPSS 22.0软件进行统计学分析。采用χ2检验和Mann-Whitney U检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PSMA和CD31的表达

PSMA和CD31免疫组织化学染色阳性均见于肿瘤血管内皮细胞，肿瘤细胞未见染色（图1）。CRC组织PSMA染色阳性率为76.7%（69/90），高于正常结直肠组织，而癌旁组织、血管中染色阳性率为0（0/90），差异具有统计学意义（χ2=111.892，P＜0.01）。不同的CRC组织中可见不同深浅和血管范围的染色（图2），表明不同的CRC中PSMA表达强度不同。

图1 代表性PSMA和CD31免疫组织化学强染色结果（SP×400）

2.2 PSMA表达与CRC临床病理因素的关系

PSMA染色评分在不同年龄及组织学类型中具有显著性差异，高年龄组（≥60岁）及普通型腺癌组的PSMA染色评分更高（P＜0.05，表1），在不同性别、病理分级、TNM分期、浸润深度及有无淋巴结转移和远处转移的患者中无显著性差异。

图2 PSMA和CD31的表达情况（SP×200）

表1 PSMA染色评分与临床病理因素的关系 n（%）

3 讨论

CRC的诊断与分期对治疗方案的优化具有重要意义，分子影像学在这一方面具有独特的优势。作为具有高灵敏度与高特异性的肿瘤核医学显像新技术，PSMA PET/CT在前列腺癌显像方面已趋于成熟［4-6］。作为肿瘤特异性标志物，PSMA高度过量表达于前列腺癌细胞及多种肿瘤新生血管（其中包括CRC），正常组织少有表达，靶向PSMA的显像试剂可实现有效针对病灶的高特异性核素浓聚，从而达到检测目的［7-11］。在非前列腺癌显像领域，PSMA PET/CT显像仍处于起步阶段，尚缺乏系统性的理论及应用论证。随着PSMA PET/CT技术的发展与推广，CRC显像病例已有报道［17-21］。早期PSMA抗体显像试剂J519的论证性实验对4例CRC患者均成功显像，显像率为100%［17］。为明确PSMA对CRC的样本覆盖率，Haffner等［11］与 Abdel-Hadi等［16］分别对澳大利亚及埃及患者样本进行了统计，结果显示PSMA在高达75%～85%的CRC患者样本肿瘤新生血管中表达，但PSMA表达与临床病理因素的相关性仍存在不一致，如PSMA表达与远处转移是否存在相关性等。

为实现将PSMA PET显像运用拓展至中国CRC患者，首先要明确PSMA在中国CRC患者中的表达情况。因此本文运用免疫组织化学实验方法研究了90例中国CRC患者样本。研究显示，PSMA主要表达于肿瘤的新生血管内皮细胞，而在肿瘤细胞、正常组织、正常组织血管中均无表达，与既往报道结果一致［8-9，11，16］。PSMA是一种跨膜糖蛋白，它在血管内皮细胞的表达为充分接触显像试剂并实现核素的靶向浓聚提供了基本条件。PSMA染色结果显示其阳性率为76.7%（69/90），明显高于正常结直肠组织0（0/90），说明本组中国CRC患者的PSMA存在高样本覆盖率，可能与其他非亚洲患者的研究存在一致性。

本研究结果显示，不同年龄及组织学类型组患者的PSMA表达评分不同，高龄（≥60岁）和普通型腺癌（对比黏液腺癌）患者有着更高的PSMA表达。高龄CRC患者PSMA表达更高，这意味着该类人群采用PSMA进行相关诊疗可能更具优势。中国CRC患者以普通型腺癌为主，有研究报道，特殊类型腺癌如黏液腺癌、未分化癌等，仅占不到15%，普通型腺癌占所有结直肠恶性肿瘤的81.7%［22］，与国外报道的数据相当［23］。普通型腺癌中的高PSMA表达使得这一分子靶点更具优势。鉴于目前有关PSMA与CRC的临床病理因素关系的研究结论仍不明确，仍需更大样本的研究证实PSMA表达情况。

本研究结果为PSMA PET在中国CRC患者中的显像可行性提供了有力的依据。随着PSMA靶向技术的完善，其已被应用于引导放射性核素进行晚期前列腺癌患者的治疗工作，并取得突破性进展，并已有治愈病例的报道［24-25］。CRC患者样本PSMA的高阳性率及表达强度，为该治疗技术的引入以及晚期CRC患者的治疗提供另一种可选方案。更多深入的样本分析、机制研究以及临床显像工作，已在开展中。

致谢：感谢西安艾丽娜生物科技有限公司提供组织切片及病例资料。