利用鱼类性逆转技术创制黄颡鱼XX雄鱼的方法

杨天毅 熊 阳 丹 成 郭稳杰 刘汉勤 桂建芳, 梅 洁

(1. 华中农业大学水产学院，武汉 430070; 2. 武汉百瑞生物技术有限公司，武汉 430070;3. 中国科学院水生生物研究所，淡水生态与生物技术国家重点实验室，武汉 430072)

黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidracoRichardson) 在分类上隶属于鲶形目, 鲿科, 黄颡鱼属, 是我国重要的淡水经济鱼类之一, 2016年年产量高达41.7×107kg[1]。由于黄颡鱼雄性比雌性生长快, 培育全雄黄颡鱼对于提高黄颡鱼产量有着十分重要的意义。王达等[2]和丹成等[3]成功分离得到黄颡鱼X和Y染色体连锁标记, 桂建芳等[4,5]开拓出了一条X和Y染色体连锁标记辅助的全雄鱼培育技术路线。基于此, 刘汉勤等[6,7]大规模培育出全雄黄颡鱼,2010年经国家水产原种和良种审定委员会审定为新品种全雄黄颡鱼“全雄1号”。

全雄黄颡鱼“全雄1号”的出现极大推动了黄颡鱼产业的发展。近年来, 亲本超雄鱼繁育系经过多代自交之后发生了退化, 且繁育所用的母本没有经过系统选育, 非常混杂, 制约了全雄黄颡鱼的生产推广。瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelliRichardson), 俗称江黄颡, 其生长速度和成活率显著高于黄颡鱼[8,9]。杂交黄颡鱼(黄颡鱼♀×瓦氏黄颡鱼♂)的形态特征和黄颡鱼非常接近, 但其受精率和生长速度明显优于黄颡鱼[10,11]。同样, 杂交黄颡鱼繁育所用的母本也非常混杂, 苗种畸形率高。由于子代的很多生长性能是由母本决定的, 建立一个优良性状稳定的全雌配套系对于全雄黄颡鱼和杂交黄颡鱼的生产尤为重要。刘汉勤等[6]利用人工雌核发育技术, 发现其雌鱼的雌核生殖子代中有96.9%的雌鱼;由此推测黄颡鱼的性别决定类型是雌性配子同型(XX♀/XY♂)。基于此, 我们设计了一条全雌黄颡鱼配套系的生产技术路线, 通过性逆转技术将XX雌性黄颡鱼逆转为XX雄性黄颡鱼, 然后XX雄性和雌性黄颡鱼繁殖后即可获得大量XX雌鱼[12]。

人工诱导鱼类性逆转方法主要有2种: 其一是添加外源激素直接改变体内激素水平诱导性逆转,常见的药物有 17α-甲基睾酮(MT)、11-酮基睾酮(11-KT)、17β-雌二醇(E2)等; 其二是添加抑制剂药物干扰体内激素与受体结合, 降低鱼类性激素水平,例如芳香化酶抑制剂来曲唑(LZ)等。利用MT处理人工诱导黄颡鱼性逆转的研究也曾有报道, 但其结果存在争议。姚道霞等[13]在出苗10d开始使用激素处理过的饵料(激素剂量为20 μg/g)喂养黄颡鱼, 持续投喂3个月, 处理组黄颡鱼中雄性比例高达90.9%。Shen等[14,15]使用MT和LZ两种药品对黄颡鱼进行转雄处理, 处理方法为10日龄至59日龄之间采用连续投喂药物浸泡的丰年虫处理。结果发现,用MT处理的黄颡鱼并没有显著改变其性别比, 但所有处理组都诱导出一定比例的间性性腺; 而3种浓度的LZ口服处理分别产生了75%、83.3%和75%的雄性。但这些研究过程中并未使用到性染色体连锁的分子标记, 不能区分XY和XX雄鱼, 故不能确定是否获得XX雄鱼[13—15]。在本研究中, 我们使用不同浓度17α-甲基睾丸酮(MT)和来曲唑(LZ)处理黄颡鱼鱼苗, 并应用性染色体连锁分子标记, 希望探索出XX雌性黄颡鱼转雄的切实可行方法, 并获得XX雄鱼。

1 材料与方法

1.1 实验材料、实验动物和实验设计

实验鱼亲本均为湖南田家湖收集的野生黄颡鱼, 实验鱼苗为野生亲本经人工授精孵化所得, 出膜后3d用丰年虫开口, 7日龄进行激素和药物处理实验。在7—29日龄期间, 用不同浓度的MT (25和50 μg/L)和LZ (100、300和1000 μg/L)浸泡丰年虫1h后再投喂。在30—60日龄期间, 用对应浓度的MT (25和50 mg/kg)和LZ (100、300 和1000 mg/kg)拌入微粒饲料后再投喂(饲料购自湖州亿盛饲料有限公司, 主要成分: 粗蛋白≥45.0%, 粗脂肪＞5.0%,粗纤维≤6.0%, 灰分≤15.0%, 水分≤10.0%)。MT和LZ溶于95%的乙醇, 拌入微粒饲料后于40℃中烘干4h, 对照组仅加入95%乙醇。实验共6个组:0 (对照组)、MT25、MT50、LZ100、LZ300和LZ1000。每组3个平行, 每个平行随机放入300尾鱼苗。在7—29日龄期间, 鱼苗饲养于60 L的循环水水箱中, 每天投喂3次。达30日龄时转入4 m3的流水水泥池中, 每天投喂2次。在实验期间, 水温保持26—28.5℃, 溶氧5.5—6.8 mg/L。每天清理残饵粪便, 及时换注新水。黄颡鱼性腺分化的关键时期是8—30日龄, 本次实验选择7—60日龄期间连续用药物处理, 能够完全覆盖其性腺分化的关键时期[16]。

61日龄取样鉴定, 剩下的鱼转喂正常颗粒饲料(购自正大饲料有限公司, 主要成分: 粗蛋白≥40.0%, 粗脂肪＞5.0%, 粗纤维≤10.0%, 灰分≤16.0%, 水分≤12.0%)。每个平行随机抽取30尾鱼,用乌来糖麻醉后测量体长(精确到0.1 mm)、体重(精确到0.01 g), 并统计各组存活率。再从中取出15尾进行解剖, 观察性腺发育情况。解剖后用Bouin’s液固定性腺、拍照、编号留存。再取出性腺置于PFA中继续固定, 24h后加入PBS缓冲液(PFA∶PBS=1∶4), 编号后4℃保存。与此同时, 剪取尾鳍用于性别分子鉴定。性腺照片编号、固定的性腺编号、尾鳍编号须一一对应。

1.2 基因组DNA的提取

取鳍条0.2 g左右, 使用醋酸铵法提取基因组DNA, 将DNA溶于100 μL的超纯水中, 4℃保存备用。

1.3 PCR扩增及性别鉴定

性别鉴定的PCR引物来源于Dan等[3]分离得到的黄颡鱼性染色体连锁标记(XY-F: 5′-GATTG TAGAAGCCATCTCCTTAGCGTA-3′; XY-R: 5′-CATGTAGATCACTGTACAATCCCTG-3′)。PCR反应体系为10 μL: 2×EsTaqMaster Mix (Dye)5 μL, 上下游引物各0.5 μL (10 μmol/μL), 模版1 μL(50 ng/μL), 加ddH2O补至10 μL。PCR反应程序为:94℃预变性3min, 34个循环(94℃ 30s, 59℃ 30s,72℃ 40s), 72℃ 5min。PCR反应在T100 Thermal Cycler (Bio-Rad, 美国)上进行。得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳, 再利用凝胶成像系统依据片段长度鉴别出XY和XX。XY为2条带(826和955 bp),XX为一条带(955 bp)。

1.4 性腺组织学观察

将各组鉴定出的XX鱼性腺样本送往谷歌生物技术有限公司做常规石蜡切片, HE染色后在显微镜下观察性腺发育状况、拍照并统计性别比例。

1.5 数据分析

数据均以平均值±标准误表示, 采用SPSS 18.0对所得数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA), 若差异达到显著水平, 则采用Duncan氏法进行多重比较, 显著性水平P＜0.05。

2 结果

2.1 MT和LZ处理对黄颡鱼存活率及生长的影响

利用 SPSS 软件对6组黄颡鱼(每组3个平行重复)在61日龄时的存活率、体长以及体重进行差异显著性检验(表1)。在7—61日龄处理期间, 5个实验组黄颡鱼的存活率与对照组无显著差异; 在61日龄时, 对照组幼鱼平均体长和3个LZ处理组无显著差异, 而显著高于2个MT处理组; MT25、MT50、LZ100三组幼鱼平均体重与对照组差异显著, 而LZ300、LZ1000两组与对照组无显著差异。以上结果说明, MT和LZ对黄颡鱼存活无明显影响, 综合61日龄各组幼鱼平均体长和体重两组数据可得出:MT对黄颡鱼鱼苗生长有明显的抑制作用, 而LZ对其生长的影响不明显。

2.2 MT和LZ处理对XX黄颡鱼性腺发育的影响

61日龄时, MT和LZ处理的黄颡鱼外表均有雄性生殖突, 但不能单一从外观来确定性别。我们将各组黄颡鱼个体通过性别分子标记进行性别鉴定(图1)后进行性腺的组织学观察, 6组实验鱼的性腺发育情况及所占比例结果见表2。61日龄对照组正常卵巢(图2A-B)和正常精巢(图2C-D)的外观结构和组织学观察结果如图2所示。在MT25和MT50处理组的XX黄颡鱼中, 发现其性腺外观结构与普通XX卵巢的宽条型结构明显不同, 与普通XY精巢性状类似但没有精小叶结构(图3A和图3C); 组织切片观察显示MT25和MT50处理组的XX性腺有精小囊结构, 但里面为空腔(图3B和图3D)。结果显示2个MT处理组的黄颡鱼均未成功逆转, 全部表现为发育不良的精巢。

表1 61日龄时不同浓度MT和LZ处理组的存活率、体长及体重统计Tab. 1 Effects of various doses of MT and LZ on survival rate, total length, and weight at 61 days post fertilization (n=30)

图1 利用PCR反应鉴定黄颡鱼遗传性别的示意图Fig. 1 The genetic sex of yellow catfish was identified by polymerase chain reaction (PCR) method with the sex-linked markers

表2 61日龄不同浓度MT和LZ处理组的XX基因型黄颡鱼的性腺结构统计Tab. 2 The effects of various doses of MT and LZ on the gonad of XX yellow catfish at 61 days post fertilization (n=15)

图2 61日龄对照组正常卵巢和精巢结构Fig. 2 The phenotype and histology of normal ovary and testis at 61 days post fertilization in the control group

在LZ处理组中, 所有的XX性腺均表现为发育不良的精巢或者完全发育的精巢(表2)。在LZ100处理组中, 绝大多数只能逆转成没有精小叶的不良精巢(图4A-B), 有少部分为有半截正常精小叶的不良精巢(图4C-E)。此外, 3个LZ处理组中仅有LZ300与LZ1000出现了完全逆转的XX精巢(图4F-G)。LZ300与LZ1000出现的完全逆转的XX精巢的比例分别为20.0%和35.7% (表2)。以上结果表明: 低浓度的MT (25 mg/kg、50 mg/kg)和低浓度的LZ (100 mg/kg)均不能使XX黄颡鱼完全性逆转; 随着LZ的浓度升高, XX黄颡鱼无精小叶和有部分精小叶的不良精巢比例逐渐降低, 正常精巢的比例逐渐增高, 向雄性逆转的趋势逐渐增强。

图3 61日龄MT处理组XX黄颡鱼性腺结构Fig. 3 Dysplastic testis after MT treatment at 61 days post fertilization

图4 61日龄LZ处理组XX黄颡鱼性腺结构Fig. 4 The phenotype and histology of XX gonad after LZ treatment at 61 days post fertilization

图5 一龄XX生理雄鱼性腺结构Fig. 5 Gonad structure of one-year-old XX physiological male

2.3 一年龄XX生理雄鱼性腺发育及繁殖力

我们对成功逆转的XX生理雄鱼性腺发育进行了追踪, 1周年后解剖观察, 取成功逆转发育良好的XX精巢和正常XY雄鱼精巢做切片和HE染色比较分析。解剖显示, XX生理雄鱼精巢发育良好, 但与XY正常雄鱼精巢相比略显细小(图5A和图5C)。组织学观察显示, XX生理雄鱼精巢发育正常, 精小囊中充满了精子, 与XY正常雄鱼精巢相比没有明显差异(图5B和图5D)。用完全逆转的XX生理雄鱼分别与XX雌鱼和YY雌鱼交配, 统计受精率, 并对其子代做性别分子鉴定。结果显示, XX生理雄鱼受精率略低于XY正常雄鱼, 但整体受精状况良好(表3)。对繁育出的子代做性别连锁分子鉴定显示, XX♂× XX♀的子代全为XX, XX♂×YY♀子代全为XY (图6)。以上结果说明, 由LZ处理成功逆转的XX生理雄鱼性腺后期发育稳定, 能够正常繁殖,并具备较好的繁殖能力。

表3 XX生理雄鱼受精率统计Tab. 3 The fertilization rate of XX physiological male

图6 子代性别分子鉴定Fig. 6 The sex genotype of offspring was identified by PCR method with the sex-linked markers

3 讨论

鱼类的性别决定可分为遗传型性别决定和环境型性别决定两类[17—20]。但无论哪种性别决定型,性激素在性别分化或转变过程中都起着至关重要的作用。17α-甲基睾酮(MT)是一种人工合成雄激素, 其诱导鱼类从雌性向雄性逆转的机制有2种观点: (1)MT直接作用于卵巢或对下丘脑-垂体轴产生正反馈作用促使分泌促性腺激素(GTH), 进而诱导原始生殖细胞和性腺向精巢组织分化[21]; (2)MT通过抑制卵巢中芳香化酶基因(P450 aromatase)表达导致雌二醇(E2)总量降低而引起性逆转[22]。

MT已被广泛应用在鱼类性逆转的研究中。李广丽等[23]采用腹部埋植MT的方法处理2龄雌性赤点石斑鱼(Epinephelus akaara), 结果发现性腺中卵细胞退化,精原细胞增殖,出现大量精母细胞和精子细胞。其他的几种石斑鱼如鲑点石斑鱼(Epinephelus trimaculatus)[24]、黄腹石斑鱼(Epinephelus marginatus)[25]和白纹石斑鱼(Epinephelus aneus)[26]中,MT也被证明能有效促进性逆转。此外, MT也能诱导虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[27]、剑尾鱼(Xiphophorus helleri)[28]、麦穗鱼(Psedorasbora parva)[29]和尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)[30]等鱼类雌性向雄性逆转。姚道霞[13]在早前报道中表示用MT能使黄颡鱼发生性逆转, 但和大多数此类报道一样,她的研究中也未使用到性别标记, 因此MT诱导黄颡鱼性逆转的真实效果有待进一步验证。而且Shen等[14,15]使用MT (50和100 mg/kg)对黄颡鱼进行转雄处理, 结果发现用MT处理的黄颡鱼并没有显著改变其性别比, 但所有处理组都诱导出一定比例的间性性腺。前期, 我们使用高剂量的MT (200 mg/kg)在相同时期处理黄颡鱼鱼苗, 并未获得功能性XX生理雄鱼。有趣的是经处理过后的黄颡鱼无论是XX还是XY均表现为外有雄性生殖突, 内为卵巢的结构。这种现象也曾有过报道, 用高剂量MT或长时间处理会导致某些鱼类雌性化[31—33]。解释这种现象的说法为: 从外部摄入的MT等雄性激素在鱼体内被芳构化, 转变成了雌激素; XY雄性个体的内源性雄激素受到摄入的外源性雄激素的干扰而停止合成[34]。基于此, 我们只设定用2个低浓度的MT处理组(25和50 mg/kg)。

此次实验结果表明用MT处理黄颡鱼对鱼苗的存活率几乎没有影响。低浓度的17α-甲基睾酮能够抑制黄颡鱼鱼苗的生长, 且不能将XX黄颡鱼完全诱导成雄鱼, 这与MT处理大口黑鲈(Micropterus salmoides)[35]和大梭鱼(Esox masquinongy)[36]的结果相似。同时在2个MT处理组中, 鉴定出来的XY鱼性腺也出现了退化, 精巢全部呈空泡状(结果未显示)。在之前的报道中, 100 mg/kg的MT处理组也出现空泡化精巢[14,15]。MT对正常雄性黄颡鱼精巢的空泡化效应可能是由于MT被芳香构化产生雌激素所导致。用200 μg/L MT处理黑头呆鱼(Pimephales promelas)后, 雌鱼和雄鱼血清卵黄蛋白原水平都显著升高[34]。

芳香化酶是雌激素合成过程中的关键因子, 是催化生物体内雄激素向雌激素转化的关键酶和限速酶, 它将芳构化雄烯二酮和睾丸酮分别催化合成为雌酮和雌二醇[37]; 性腺发育时期的雌雄激素水平比例是由芳香酶决定的[38]。因此芳香化酶的活性对动物性别分化是至关重要的, 活性低向精巢发育,活性高则向卵巢发育[39]。在斑马鱼(Danio rerio)中,将芳香化酶基因cyp19a1a敲除后, 突变体全为雄性[40]。Letrozole (来曲唑, LZ), 是一种能够有效抑制芳香酶活性的非固醇类抑制剂, 能有效抑制雌激素的合成。使用LZ处理黄颡鱼、暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)、胡子鲇(Clarias fuscus)、鲤(Cyprinus carpio)、黄姑鱼(albiflora croaker)和青鳉(Oryzias latipes)等鱼类的幼鱼均能大大提高雄性率, 但均未使用性别标记来鉴定该雄鱼的基因型[14,15,41—45]。在我们的研究中, 结合LZ处理和性别连锁分子标记鉴定的方法, 评估LZ在黄颡鱼中是否能有效诱导XX雌鱼向XX雄鱼性逆转。当LZ剂量达到300 mg/kg时, 约20%的XX雌鱼被逆转为能够正常繁殖的生理雄鱼。且随着其LZ剂量的进一步增大, 逆转的成功率也随之升高。

在正常情况下, 黄颡鱼卵巢分化要早于精巢分化。在13日龄时卵巢便开始出现分化趋势, 19日龄就能形成卵巢腔。而精巢分化时间大概在40日龄,直到55日龄才形成精细小管和输精管[13]。由此可知, 在本实验初期, XX雌鱼性腺就已先开始发育,此时促卵泡激素就已开始刺激性腺分泌雌二醇。同时促性腺激素又可以调节芳香化酶基因的表达和芳香化酶的活性来刺激卵巢分泌雌二醇[46]。在XX黄颡鱼性腺中, 当摄入17α-甲基睾酮后, 芳香化酶的活性并未被完全抑制, 仍可将体内部分雄激素转化成雌激素, 故性腺不能分化成正常精巢。当摄入足够剂量的来曲唑(300和1000 mg/kg)时, 鱼苗体内芳香化酶的活性被有效地抑制, 导致雄激素转化成雌激素的通路被阻断, 鱼体内雌激素合成减少而雄激素大量积累, 性腺就可以朝精巢方向分化。由此可以说明黄颡鱼早期雌激素合成对于维持雌性的发育起着至关重要的作用, 只要芳香化酶的活性不被有效抑制, 17α-甲基睾酮就不能诱导黄颡鱼逆转。而黄颡鱼转雄的关键在于XX鱼体内能促进生成雌激素的芳香化酶活性是否被抑制。此次实验探索出了有效将XX生理雌性黄颡鱼转化为XX生理雄鱼的诱导方法, 为黄颡鱼全雌配套系的构建奠定了基础。