达氏鲟gpr54基因的克隆及Kisspeptin注射对其表达的影响

岳华梅 叶 欢 阮 瑞 刘志刚 李创举

(中国水产科学研究院长江水产研究所, 农业农村部淡水生物多样性保护重点实验室, 武汉 430223)

G蛋白偶联受体54 (GPR54)为Kisspeptin (由kiss-1基因编码)的天然受体, 因此也被称为Kiss1r(Kiss-1 receptor), 最先在大鼠(Rattus norvegicus)中被鉴定出来[1]。GPR54突变将导致小鼠(Mus musculus)丧失生殖功能, 并引发低促性腺激素性功能减退症[2,3]。此外, 敲除小鼠kiss或gpr54均对下丘脑-垂体-性腺轴(BPG轴)功能造成严重影响, 从而确立了kisspeptin/GPR54系统在脊椎动物生殖调控中的重要地位[4—6]。随后的研究发现, Kisspeptin可通过激活促性腺激素释放激素(Gonadotropin-Releasing Hormone, GnRH)神经元的下丘脑通道, 刺激促性腺激素(Gonadotropin, GTH)的分泌, 进而控制生殖轴的各种生理活动[7—9]。Parhar等[10]在罗非鱼(Oreochromis mossambicus)中首次报道了gpr54和gnrh神经元中存在共表达, 为Kisspeptin/GPR54系统通过作用于GnRH参与鱼类生殖调控和青春期启动提供了第一证据。此后, 在军曹鱼(Rachycentron canadum)、鲻鱼(Mugil cephalus)、斑马鱼(Danio rerio)、青鳉(Oryzias latipes)等鱼类中相继发现了GPR54基因的存在[11—14]。进一步的功能分析证明,GPR54可通过与配体Kisspeptin相结合参与鱼类的青春期启动调控、性类固醇激素对促性腺激素的正负反馈调控、雌性动情周期的分子调控及季节繁殖活动调控等[15,16]。

达氏鲟(Acipenser dabryanus)隶属于鲟形目, 为我国特有的淡水定居型鱼类, 主要分布于金沙江下游和长江上游。由于水利水电工程建设、航运、水体污染和过度捕捞等人类活动的影响, 达氏鲟生存环境遭到严重破坏, 物种处于极度濒危状况, 已于1988年被列为国家一级保护动物[17]。达氏鲟规模化全人工繁殖技术虽已突破, 但是人工养殖达氏鲟仍然面临初次性成熟时间长、雌雄发育不同步等问题, 限制了其物种资源恢复。为了研究达氏鲟生长生殖的调控机制, 我们通过在饲料中外源添加生长激素GH及促性腺激素FSH饲喂不同年龄的达氏鲟, 结果显示一定剂量的GH添加可提高鱼体肝和肌肉中蛋白质、水分含量, 降低脂肪含量[18], 而FSH添加则可促进二龄达氏鲟精巢的发育[19]。本研究旨在克隆得到在达氏鲟生殖发育中发挥重要功能的gpr54基因, 分析其序列特征和系统进化关系, 研究其组织表达特征。另外, 通过Kisspeptin多肽注射研究Kisspeptin/GPR54系统对下丘脑中gnrh基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验鱼

实验鱼取自中国水产科学研究院长江水产研究所太湖试验场(湖北荆州), 为全人工繁殖的子二代达氏鲟。组织表达分析所选达氏鲟为3龄(雌、雄各1尾), 分别取心、肝、脾、肾、肠、性腺、垂体、下丘脑、端脑、中脑、小脑和延脑组织,RNAlater(Qiagen)保存液浸泡, 4℃保存过夜后存放于–80℃备用。Kisspeptin多肽注射实验所选达氏鲟为9月龄(300±5) g。

1.2 总RNA提取、单链cDNA及SMART cDNA合成

采用RNeasy®Plus Mini Kit试剂盒(QIAGEN,德国)进行组织总RNA的提取; 参照PrimeScript®RT reagent Kit With gDNA Eraser (TaKaRa, 日本)试剂盒合成单链cDNA用于qRT-PCR。达氏鲟下丘脑SMART cDNA合成参考Super SMART®PCR cDNA Synthesis Kit操作手册。

1.3 达氏鲟gpr54基因全长cDNA克隆及序列分析

根据实验室已有的达氏鲟下丘脑转录组数据(未发表数据), 搜索得到gpr54基因2个亚基的序列片段信息, 分别设计引物进行PCR扩增, 产物纯化后连入pMD19-T载体, 转化大肠杆菌感受态细胞(DH5α), 挑取阳性克隆进行测序验证。本研究所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成(表1)。根据测序所得序列设计特异引物扩增得到gpr54-1和gpr54-2 cDNA的5′端和3′端, 并进行克隆测序验证。利用DNAStar软件中SeqMan对获得的片段进行拼接, NCBI Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对所得序列进行比对, NCBI Conserved Domain Database对所得序列进行结构域预测(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)。应用Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo)对推导的氨基酸序列与其他脊椎动物进行序列一致性比对, 并利用MEGA 6.0软件以邻接法(Neighbor-Joining, NJ)构建系统发生树, 自展法(Bootstrap)检验系统分支的置信度(重复次数为1000)。

1.4 实时荧光定量PCR

根据所得到达氏鲟gpr54 cDNA序列设计定量引物(表1), 以所取3龄达氏鲟的各部分组织及多肽注射处理所取下丘脑组织的cDNA为模板, 进行qRT-PCR反应。达氏鲟gnrh定量PCR引物(gnrh1和gnrh2)设计参考中华鲟gnrh基因序列[20], 扩增后进行序列验证。实验按SYBR®Premix ExTaqTM(Perfect Real Time)试剂盒说明书进行操作, 重复3次,以达氏鲟β-actin作为内参基因。扩增反应在Bio-Rad CFX96TM Real Time System仪上进行, 反应程序为95℃预变性10min, 95℃变性15s, 53℃退火15s,72℃延伸15s, 共40个循环。结果采用2–ΔΔCt分析法进行数据分析。

表1 本研究所用引物序列Tab. 1 Primers used in the present study

1.5 Kisspeptin多肽注射

通过在达氏鲟下丘脑转录组(未发表数据)中进行搜索, 得到达氏鲟kisspeptin基因(kiss-1、kiss-2)包含编码核心十肽的序列信息, 并进行序列验证。达氏鲟Kiss-1、Kiss-2核心十肽序列分别为: YN WNSFGLRY及FNFNPFGLRF。核心十肽由生物工程(上海)有限公司合成, 采用分析级HPLC进行纯度测定(＞95%)。采用0.7% NaCl溶液对所得多肽干粉进行溶解, 配置成浓度为10 nmol/L和1000 nmol/L的多肽溶液。

30尾9月龄达氏鲟(300±5) g被随机分为5组, 其中1组为对照组, 另外4组为多肽注射组。达氏鲟经0.05% MS-222麻醉后, 分别将10、1000 nmol/L的Kiss-1、Kiss-2多肽溶液经腹腔注射入体内, 注射体积为20 μL/g。注射后12h, 分别取每尾鱼的下丘脑组织, RNAlater(Qiagen)保存液浸泡, 4℃保存过夜后存放于–80℃备用。采用qRT-PCR对下丘脑中gpr54及gnrh基因的转录水平进行检测。

1.6 统计分析

实验数据用平均值±标准误(Mean±SEM)表示,采用SPSS 22.0进行统计分析。对各实验组数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA), 当方差齐性时采用Duncan多重比较分析, 当方差非齐性时采用Dunnet’s T3多重比较分析,P＜0.05表示差异显著,P≥0.05表示没有显著性差异。使用GraphPad Prism 5.0软件进行制图。

2 结果

2.1 达氏鲟gpr54基因全长序列扩增及序列分析

本研究克隆得到了达氏鲟2个gpr54基因全长cDNA序列, 分别命名为dsgpr54-1和dsgpr54-2(Gen-Bank登录号: MH025536和MH025537)。dsgpr54-1的全长cDNA序列为2016 bp, 包含367 bp的5′UTR、编码379个氨基酸的1140 bp的ORF和509 bp的3′ UTR。达氏鲟dsgpr54-2的全长cDNA序列为1980 bp, 由368 bp的5′ UTR、1140 bp的ORF(编码379个氨基酸)及472 bp的3′ UTR构成。结构域预测发现, 达氏鲟Gpr54-1和Gpr54-2的氨基酸序列均包含保守的7个跨膜结构域。

将推导的达氏鲟Gpr54氨基酸序列与其他代表性脊椎动物的同源序列进行多重比对, 结果表明,达氏鲟Gpr54-1与爬行类的西部锦龟(Chrysemys picta bellii)及两栖类的非洲爪蟾(Xenopus laevis)的Gpr54-1序列一致性较高, 均超过70%, 而与几种真骨鱼类的Gpr54-1及其他脊椎动物的Gpr54-2一致性较低, 为58%—65%。达氏鲟Gpr54-2与巴西龟(Trachemys scripta elegans)的同源序列一致性最高(73.02%), 与施氏鲟(Acipenser schrenckii)及热带爪蟾(Xenopus tropicalis)同源序列的一致性也较高, 分别为69.66%、69.61%。另外, 达氏鲟Gpr54的7个跨膜结构区(TMD)较为保守, 与其他物种的跨膜区序列一致性较高。

运用Mega 6.0软件构建了基于Gpr54氨基酸序列的NJ系统发育树(图1), 果蝇(Drosophila melanogaster)AlstR序列作为外类群, 所得结果与氨基酸多重比对结果一致。达氏鲟Gpr54-1先与爬行类的西部锦龟聚为一支, 然后再与两栖类的热带爪蟾聚为一类。达氏鲟Gpr54-2先与爬行类的巴西龟聚为一支, 然后与施氏鲟及两栖类的热带爪蟾的聚类支再聚为一支。这表明鲟鱼Gpr54与四足动物的亲缘关系较近。

2.2 达氏鲟gpr54 mRNA的组织表达特征

采用荧光定量PCR法检测了gpr54 mRNA在达氏鲟各组织(心、肝、脾、肾、肠、性腺、垂体、下丘脑、端脑、中脑、小脑和延脑)中的表达。dsgpr54-1在性腺(精巢、卵巢)及脑组织(下丘脑、垂体、端脑、中脑)中有分布, 且在下丘脑中转录水平最高。而dsgpr54-2只在脑组织中转录, 且在垂体、下丘脑及延脑中表达丰度都较高(图2)。

2.3 Kiss多肽注射对下丘脑中gpr54及gnrh基因表达的影响

图1 采用MEGA 6.0软件构建的基于Gpr54氨基酸序列的NJ系统进化树Fig. 1 NJ phylogenetic tree based on Gpr54 amino acid sequences by MEGA 6.0

与对照相比, 不同浓度Kiss-1、Kiss-2注射均引起下丘脑中dsgpr54-1和dsgpr54-2表达量升高, 并且10 nmol/L Kiss-2注射能够显著促进dsgpr54-2的表达(P＜0.05)(图3A)。另外, 不同浓度Kiss-1注射造成了dsgnrh1和dsgnrh2转录水平的下降, 但是差异都不显著(P＞0.05)。而不同Kiss-2注射对2个gnrh基因的表达影响完全相反(图3B)。10 nmol/L Kiss-2注射使得dsgnrh1表达量上升,dsgnrh2的表达量下降; 1000 nmol/L Kiss-2注射则引起dsgnrh1表达量的下降,dsgnrh2的表达量没有显著变化(图3B)。上述研究结果表明, 达氏鲟gpr54-1和gpr54-2均能与其配体kiss-1、kiss-2相结合, 但kiss-2更倾向于与gpr54-2相结合。Kiss-1、Kiss-2通过与Gpr54相结合, 调控下丘脑中gnrh基因的表达, 且其调控功能存在差异。

3 讨论

3.1 达氏鲟gpr54基因的序列特征及进化分析

本研究从达氏鲟下丘脑中克隆得到2个gpr54基因, 其氨基酸序列中均包含7个保守的跨膜结构域, 暗示其具有保守的生物学功能。研究表明, 在具有胎盘的哺乳动物(人、鼠)及爬行类中只发现有一个gpr54基因, 而在哺乳类的鸭嘴兽(Ornithorhynchus anatinus)中克隆得到2个gpr54基因。迄今为止, 在鸟类中还没有发现kiss或gpr54基因的存在[21]。与哺乳动物不同, 在一些真骨鱼类(如斑马鱼、青鳉、金鱼)、辐鳍鱼纲的雀鳝(Lepidosteus platystomus)以及肉鳍鱼纲(腔棘鱼Coelacanth)中都发现有2个gpr54基因[22]。基因组共线性分析暗示这些同源基因起源于脊椎动物早期进化中的2次基因组复制[23]。本文在达氏鲟中也鉴定了2个gpr54基因, 根据氨基酸序列比对及进化树分析结果推测,其应该为真骨鱼类gpr54的直系同源基因。另外氨基酸序列比对结果还发现达氏鲟Gpr54与四足类(爬行类、两栖类)的序列一致性高于真骨鱼类, 进化树分析结果进一步证实了此结果。对达氏鲟生长激素GH的氨基酸序列研究也表明其同两栖类的非洲爪蟾的一致性要高于几种真骨鱼类[24]。这暗示达氏鲟作为一种比较原始的软骨鱼类, 在遗传上与四足类脊椎动物的亲缘关系要近于真骨鱼类。

图2 达氏鲟gpr54基因在不同组织中的表达Fig. 2 The transcription distribution of gpr54 in different tissues of Dabry’s sturgeon

图3 达氏鲟Kiss-1及Kiss-2核心十肽注射对下丘脑中gpr54(A)及gnrh(B)基因表达的影响Fig. 3 The transcription changes of gpr54 (A) and gnrh (B) genes in the hypothalamus of Dabry’s sturgeon by decapeptide injection of Kiss-1 and Kiss-2

3.2 达氏鲟gpr54基因的组织表达特征分析

在不同的脊椎动物中,gpr54基因具有不同的组织表达特征。黑头呆鱼(Pimephales promelas)及星点东方鲀(Takifugu niphobles)的gpr54基因只在性腺以及脑中有表达[25,26]。金鱼的gpr54基因除了在脑及性腺中有转录外, 在脂肪等外周组织中也发现有表达[27,28]。斑马鱼[29]、青鳉[30]、海鲈(Lateolabrax japonicus)[21]、塞内加尔鳎(Solea senegalensis)[31]及大西洋比目鱼(Hippoglossus hippoglossus)[32]等鱼类中也发现gpr54基因在脑组织中大量表达。本文对达氏鲟的研究显示,dsgpr54-1只在脑和性腺中有转录, 且在脑中表达量高于性腺, 而dsgpr54-2在脑中特异表达(图2)。本文的研究结果与上述鱼类中的结果较为一致, 这进一步印证了gpr54基因对鱼类生殖活动调控的重要功能。另外, 与青鳉中的研究结果类似[30], 达氏鲟dsgpr54-1及dsgpr54-2在下丘脑中具有较高转录水平, 这暗示其可能参与调控下丘脑中GnRH神经元的功能。

3.3 Kisspeptin/GPR54系统对GnRH的调控功能分析

Kisspeptin多肽注射是研究Kisspeptin/GPR54系统对生殖调控影响的重要途径。在金鱼中, 2种kisspeptin的核心十肽均能有效地结合2种Gpr54, 激活受体下游信号, 但表现出一定的受体-配体选择性差异, 即Kiss-1对Gpr54a的结合更为敏感, 而Kiss-2则主要与Gpr54b相结合, 激活其下游的SRE、CRE信号[33]。在本文的研究中, 达氏鲟Kiss-1及Kiss-2核心十肽注射均能引起下丘脑中dsgpr54-1及dsgpr54-2转录水平的升高, 但是10 nmol/L Kiss-2注射能够显著促进dsgpr54-2的表达(图3A)。这表明达氏鲟的kiss基因对gpr54受体的结合也具有偏好性,kiss-2更倾向于与gpr54-2相结合。

另外, 在黑头呆鱼中kisspeptin-10注射可引起gnrh3 (hypophysiotropicgnrhtype, 促垂体型gnrh)基因表达量显著上升, 而gnrh2表达没有显著变化[25]。在斜带石斑鱼中, Kiss2-10注射可引起雌鱼gnrh1 (促垂体型)的表达上升, 而gnrh3的表达不受影响[34]。在本文中, 10 nmol/L Kiss2-10注射也引起达氏鲟下丘脑中gnrh1 (促垂体型)的转录水平上升(图3B), 这与上述结果较为一致。但是, 当Kiss2-10注射浓度提高至1000 nmol/L时,gnrh1的表达量反而下降, 这说明当体内Kiss2浓度过高时, 可能引起了达氏鲟鱼体的应激反应, 抑制gnrh1的表达。尽管达氏鲟Kiss多肽注射均可引起gnrh1及gnrh2转录水平的变化, 但是差异都不显著(图3B)。这可能是由于达氏鲟初次性成熟年龄较长, 导致群体间的发育存在差异, 因此每组只选取6条作为试验鱼, 样本量偏少。尽管如此, 本文的结果仍然说明达氏鲟Kiss-1及Kiss-2对gnrh基因表达的影响存在差异, 这暗示2种kiss基因对gnrh存在不同的调控作用。