木姜叶柯中根皮苷与三叶苷含量测定研究*

张亚洲 ，王 涛 ，朱晶晶 ，2，刘 学 ，2，周福才 ，王 强

（1.贵州理工学院食品药品制造工程学院，贵州 贵阳 550003； 2.贵阳中医学院附属第二医院，贵州 贵阳 550001； 3.广西苷亮健生物技术有限公司，广西 南宁 530001）

木姜叶柯为壳斗科柯属植物 Lithocarpuslitseifolius（Hance）Chun.，属常绿乔木，别名甜茶（通称）、甜叶子树（云南）、胖稠（广东）、甜味菜、大叶稠子、甘茶（贵州）、多穗石柯等，以野生状态分布于我国长江以南各省区海拔500～2 500 m的低山密林中，印度、泰国也有分布[1]。现代研究表明，木姜叶柯中的黄酮类成分是其主要化学成分，主要有根皮苷与三叶苷，属二氢查尔酮类成分[2－4]。木姜叶柯（甜茶）使用广泛，于2017年6月通过了国家卫生计生委的新资源食品评审，其具有降血糖、降血压、调血脂及抗过敏、抗炎等作用，尤其所含根皮苷防治糖尿病及其并发症有独特效果[5－8]。本研究中对收集的主要产区的木姜叶柯各种市售甜茶成品及原植物中根皮苷与三叶苷含量进行测定，以了解市场上产品及原植物中根皮苷及三叶苷的含量，为木姜叶柯产品开发提供借鉴。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 Series型高效液相色谱仪（包括1260 DAD型检测器，美国安捷伦科技有限公司）；BSA124S型分析天平（赛多利斯科学仪器＜北京＞有限公司）；KQ－300DB型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司，功率为250 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

乙腈，甲醇（均为HPLC级，成都科龙试剂有限公司）；磷酸（分析纯，北京化工厂）；水为娃哈哈纯净水；根皮苷对照品（含量＞99%，批号为20161012），三叶苷对照品（含量 ＞98%，批号为20160825），均购于成都德思特生物技术公司。木姜叶柯样品为广西

表1 收集的木姜叶柯原植物部位及茶的样品信息

2 方法与结果[9－15]

2.1 药材水分测定

参照2015年版《中国药典（四部）》附录0832（干燥失重测定法第二法）测定药材水分。结果见表2。

表2 木姜叶柯药材水分测定结果（n＝3）

2.2 检测波长选择

紫外－可见吸收光谱（UV）图显示根皮苷在285 nm波长处有最大吸收，而三叶苷在275 nm波长处有最大吸收（见图1），综合考虑，确定检测波长为280 nm。

图1 紫外光谱图

2.3 样品溶液制备与超声时间选择

称取以上木姜叶柯样品0.2 g，精密称定并平行称取3份，分别置100 mL容量瓶中，用甲醇超声10，20，30 min使溶解，放冷后用甲醇稀释至刻度，摇匀。用0.45μm微孔滤膜滤过，取滤液20μL进样。结果样品超声20 min内测定效果良好。

2.4 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Phenomenex Gemini C18柱（250mm×4.6mm，5μm，美国菲罗门公司）；流动相：0.1%磷酸水溶液（A）－乙腈（B），梯度洗脱（见表 3）；流速：1.0 mL ／min；检测波长：280 nm；进样量20μL。在此条件下，根皮苷、三叶苷理论板数均大于4 000，分离度均大于1.5，色谱条件符合相关要求（见图2）。苷亮健生物技术公司供应或通过购买获得，样品均经贵阳中医学院董立莎教授鉴定为木姜叶柯，详见表1。

表3 流动相梯度洗脱表（%）

图2 高效液相色谱图

2.5 方法学考察

线性关系考察：称取根皮苷对照品25.0 mg，精密称定，置20 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得A溶液；精密称取三叶苷对照品23.0 mg置20 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得B 溶液。分别精密吸取 A 溶液 4.00，3.00，2.00，1.00，0.50，0.20，0.10 mL，B 溶液 5.00，4.00，3.00，2.00，1.00，0.50，0.25 mL；置 10 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得系列质量浓度溶液，进样，记录色谱图。结果见表4。

表4 线性关系考察结果

精密度试验：取2.5项下对照品溶液，摇匀，连续进样6次，每次20μL，计算峰面积。结果根皮苷、三叶苷峰面积平均值分别为2 968.5和10 383.9，RSD分别为0.47%和0.37%（n＝6），表明仪器精密度较好。

稳定性试验：取2.3项下方法制备的同一样品溶液，摇匀后，用微孔滤膜滤过，分别于 0，2，4，6 h 时进样20μL。平行操作2次，测定峰面积，计算含量。结果根皮苷的相对百分含量分别为100.00%，100.18%，99.96%，100.24%，三叶苷的相对百分含量分别为100.00%，99.84%，99.93%，100.10%，表明样品溶液在6 h内测定稳定性良好。

重复性试验：称取同一份样品（编号12）0.2 g（称样量分别为 0.200 3，0.201 2，0.200 2 g），精密称定并平行称取3份，分别用2.3项下样品溶液制备方法配制，进样20μL。结果根皮苷和三叶苷的平均峰面积分别为 14 856.4和51 200.5，RSD分别为0.68%和0.18%（n＝6），表明方法的重复性良好。

加样回收试验：称取已知含量样品（编号12）0.1 g，精密称定并平行称取9份，分别平行加入已知含有根皮苷（1.996 g／L）、三叶苷（6.034 g／L）的高、中、低浓度（125%，100%，75%）对照品溶液各3份，按样品含量测定方法进样测定，记录色谱图。结果见表5。

表5 加样回收试验结果（n＝9）

2.6 样品含量测定

按2.3项下样品处理方法处理样品，依法测定含量。结果见表6。

表6 药材样品中根皮苷、三叶苷含量测定结果（n＝2）

3 讨论

木姜叶柯在民间当茶叶使用，其成分至今较为明确的有根皮素、根皮苷和三叶苷等，有降血糖、降血压、调血脂及抗过敏、抗炎等作用。

曾探索在同一色谱条件下同时对根皮素、根皮苷和三叶苷进行分析，结果发现，大部分样品中根皮素含量太低，导致无法同时与根皮苷和三叶苷进行测定。对部分市场上及自采的木姜叶柯样品进行检测，发现收集到的不同产地的15批样品根皮苷与三叶苷的含量存在一定差异。老叶与枝条中成分以根皮苷为主，最高含量达9.04%，茶叶制品与鲜叶中成分以三叶苷为主，最高含量达24.35%。另就根皮苷与三叶苷总量而言，茶叶制品与鲜叶远大于老叶和枝条，其中以标示产地为广西南宁南阳乡木姜叶柯种植地区的质量较优，根皮苷与三叶苷总的含量相对较高，达31.62%，分析原因在于为鲜叶加工而成，成分含量较高，且均以三叶苷为主。

因加工方法的不同，木姜叶柯有绿茶及红茶2个品系，但从成分上来讲，制茶加工过程并未改变鲜叶中三叶苷含量多数大于根皮苷的情况，故建议木姜叶柯茶制品应在4月至9月用其鲜叶加工，所得品次较高。