可视化组胺快速检测试纸研究

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

随着人们生活水平的提高，对温饱的质量要求也有所提高。因此，人们对食品的生产质量、加工环境、流通和销售过程等各个环节的安全问题越来越关注。而食品安全监督部门的检测方法大部分为仪器分析，使用仪器分析不仅需要相关的技术人员，而且成本较高、生成报告过程较慢，因此，导致监管部门无法对检测结果及时进行汇报[1]。所以，人们对快速、准确、灵敏、低成本且能够在现场检测的食品安全分析技术越来越感兴趣[2]。试纸法，因为它的制造和使用方法简单且成本低、具有可降解性、容易进行修饰和印迹，并且它自身的多孔纤维结构可以无需其他外部动力进行富集，白色的检测背景为化学比色和荧光检测提供了合适的条件。目前，利用试纸法作为检测手段已经成为了人们广泛关注的焦点[2-3]。

组胺（histamine，HA），又名组织胺，分子式C5H9N3，化学名 4（5）－（2－氨乙基）咪唑[4]。HA 在组胺酸脱羧酶和细菌的共同作用下发生脱羧反应而产生[5]。HA属于生物碱，高含量的HA有毒性，能够引起血压降低，当人体摄入HA含量超过1.5 mg/kg时，将会引起过敏反应而导致食物中毒[6]。正常储藏的水产品HA含量不会超过50 mg/kg[7]，这种情况下一般不会引起食物中毒，只有腐败变质的食品会产生大量的HA。由于储藏技术落后导致食品腐败变质，以及国外在进出口时对我国食品安全设置的技术性贸易壁垒，都会导致我国经济的严重损失。因此，我们需要研究一种快速、简便、灵敏且能够现场检测HA的方法。目前，对水产品中HA含量的测定方法主要有分光光度法、液相色谱法、离子色谱法、薄层层析法、毛细管电泳法、荧光法、电化学法、生物学法和比色法等[8-14]。目前报道已经有检测HA的试纸[15]，但大多数方法都较为繁琐、费时、费力且成本较高，而且检测灵敏度、检测范围有待进一步提高。为了进一步简化操作程序、节约检测时间、提高检测灵敏度和扩大检测范围，研制了一种高效的可视化HA快速检测试纸法。此方法根据比色法的原理制备了组胺检测溶液，用聚离子溶液修饰后的滤纸对组胺检测溶液进行富集后具有明显的颜色变化，可以在现场进行快速检测，并且操作简便、成本低廉、对检测者没有技术要求，可以实现批量化生产，在现场检测中有广阔的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

磷酸组胺：上海源叶生物科技有限公司；对硝基苯胺、氢氧化钠、三氯乙酸：天津市福晨化学试剂厂；亚硝酸钠、碳酸氢钠：天津凯通化学试剂有限公司；无水乙醇：天津市化学试剂一厂；甲醇：天津市风船化学试剂科技有限公司；氨水：天津市北方天医化学试剂厂；盐酸、1-乙烯基-3-辛基咪唑溴盐、烯丙基三乙氧基硅烷、偶氮二异丁腈：天津市大茂化学试剂厂；鱿鱼：市售。

1.2 仪器与设备

101-IBS电热鼓风干燥箱：天津市华北实验仪器有限公司；SB-5200D超声波清洗剂：宁波新芝生物科技股份有限公司；SHB-3循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；THZ-82B恒温水浴：常州智博瑞；JY-CH-001研磨机：永康市九顺莹商贸有限公司；0.001级pH计：S220梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 载体试纸的筛选

选用快、中、慢速3种型号的定量滤纸进行试验。将试纸剪成长5 cm、宽1.5 cm的试纸条，将一定浓度的显色试剂和待测物质的溶液滴加到滤纸上，静置5 min后观察不同型号滤纸的显色效果。选择颜色变化明显、扩散度小的滤纸作为载体试纸。

1.3.2 显色体系的优化

1.3.2.1 溶解对硝基苯胺所用溶剂影响

分别以水、乙醇、不同酸性水溶液（0.5、1、1.5、2、2.5mol/L盐酸溶液）与乙醇混合液为溶剂分别溶解对硝基苯胺，观察对硝基苯胺的溶解状态以及显色效果。

1.3.2.2 溶解亚硝酸钠所用溶剂影响

因为乙醇可以调节溶剂的极性，所以将不同体积比的水和乙醇混合液（体积比 1∶10、1∶2、1∶1、3∶2、3∶1、2∶1）作溶剂溶解亚硝酸钠。观察亚硝酸钠的溶解状态以及显色效果。

1.3.2.3 显色试剂比例对显色效果影响

HA的显色体系为对硝基苯胺与亚硝酸钠的混合溶液，将两种溶液以不同体积比（1∶10、1∶2、1∶1、3∶2、3 ∶1、2 ∶1、5 ∶2）混合，并滴加一定浓度的 HA，使其显色，观察显色效果。

1.3.2.4 背景色的优化

要使HA与显色试剂反应显色，需加入碱性试剂，同时，碱性试剂也会使显色试剂显色，我们称其为背景色。GB 5009.208-2016[16]《食品安全国家标准食品中生物胺的测定》中碱性试剂为2.5 g/50 mL的碳酸钠溶液，考虑到碳酸氢钠同样为碱性试剂，为了优化背景颜色，分别配制相同浓度2.5 g/50 mL的碳酸氢钠与碳酸钠分别与显色试剂反应，观察其背景色。

1.3.2.5 待测液的比例

HA与碳酸氢钠的比例不同也会影响待测液的显色效果。将 HA 与碳酸氢钠分别以 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的体积比混合。在处理过的滤纸上分别将4种比例的待测液进行滴定，观察它们的显色效果。

1.3.3 试纸的修饰

1.3.3.1 成膜物质修饰

探究成膜物质是否会对试纸渗透作用产生影响，从而提高试纸的灵敏度。因此将聚乙烯醇溶解后浸泡到滤纸上，观察修饰过聚乙烯醇的滤纸和未加修饰的滤纸的渗透作用。

1.3.3.2 聚离子溶液修饰

先用0.5 mol/L的氨水润湿103慢速型号的滤纸，再用聚离子溶液涂抹被氨水润湿的试纸。将显色试剂分别与10、1 mg/L的HA待测溶液混合后分别滴加到用聚离子溶液修饰后的滤纸上和未修饰的滤纸上，观察显色效果。

聚离子溶液的合成：1-乙烯基-3-辛基咪唑溴盐与烯丙基三乙氧基硅烷按质量比6：20混合，用10 mL甲醇溶解，超声 5 min～10 min，冲氮气 5 min～10 min，加入偶氮二异丁腈封口超声5 min，60℃水浴加热反应24 h。

1.3.4 标准比色卡的制作

第一步将慢速滤纸裁剪长5 cm、宽1.5 cm的试纸条。

第二步将2.5 mg/mL对硝基苯胺溶液与5 mg/mL亚硝酸钠溶液以体积比3∶2混合配制成显色试剂。

第三步 配制浓度为 10 000、1 000、100、10、1、0.1 mg/L的HA溶液，分别取适量溶液于试管中，加入相同体积的碳酸氢钠，震荡，制成检测液。

第四步将显色试剂与检测液混合，待颜色稳定后，均匀滴于聚离子溶液修饰后的试纸上，吹干，密封保存留作标准比色卡。

1.3.5 样品检测

1.3.5.1 样品处理

将从当地超市购买的鱿鱼样品中取可食用的鱼肉部分，用粉碎机将鱼肉均匀绞碎，称量5.00 g的鱼肉试样，加入三氯乙酸溶液（100 g/L），密封后在水浴锅中超声5 min，将鱼肉静置浸泡3 h后过滤。残渣用蒸馏水洗涤过滤2次～3次，合并所有滤液，将滤液用氢氧化钠溶液（250 g/L）调pH值至5.00±0.05，然后移至100 mL容量瓶中用蒸馏水定容备用[17]。用以上方法提取同一样品的不同存储条件的样品1、样品2，样品1为正常冷冻状态下存储24 h的鱼肉样品，样品2为常温下储存24 h后变质的鱼肉样品。

1.3.5.2 实际样品检测

采用本研究建立的快速检测试纸法分别对提取过的样品1和样品2进行检测，观察显色情况与标准比色卡进行对比。

2 结果与分析

2.1 载体试纸的筛选

不同型号的滤纸对显色试剂与待测溶液的显色效果和扩散程度有一定的影响，将试剂分别滴于不同型号的滤纸上，结果如表1所示。

从表1中可以看出，慢速滤纸显色最佳，因此，后续所有试验都以慢速滤纸为载体。

表1 滤纸型号的影响Table 1 The effect of filter paper type

2.2 显色体系的优化

2.2.1 所用溶剂对对硝基苯胺溶解性的影响

分别以水、乙醇、不同酸性水溶液（0.5、1、1.5、2、2.5 mol/L盐酸溶液）与乙醇混合液为溶剂分别溶解对硝基苯胺，结果如表2所示。

表2 所用溶剂对对硝基苯胺溶解性的影响Table 2 Solvent effect of nitroanilineon dissolution

水作溶剂，冷却有析出，会重结晶；乙醇作溶剂，冷却无析出，不会重结晶。若溶解时不加酸，对硝基苯胺浸泡过滤纸后则纸呈黄色，纸质较硬，当浓度为2 mol/L时，显色效果最佳，背景干扰最小。因此，后续所有试验都以乙醇与2 mol/L的盐酸为溶剂溶解对硝基苯胺。

2.2.2 所用溶剂对亚硝酸钠溶解性的影响

不同比例的水和乙醇溶解的亚硝酸钠滴在滤纸上的显色效果不同，结果如表3所示。

表3 所用溶剂对亚硝酸钠溶解性的影响Table 3 Solvent effect of sodium nitrite ondissolution

水和乙醇体积比为1∶2时效果最佳。因此，后续所有试验都以体积比为1∶2的水和乙醇为溶剂溶解亚硝酸钠。

2.2.3 显色试剂比例对显色效果影响

与亚硝酸钠的混合溶液在不同比例的情况下与HA待测溶液混合的显色效果不同，结果如表4所示。

表4 显色试剂比例对显色效果影响Table 4 Effect of the color reagent ratio on the color reaction

对硝基苯胺与亚硝酸钠体积比为3∶2时显色效果最佳。因此，后续所有试验都以对硝基苯胺与亚硝酸钠体积比为3∶2作为显色试剂比例。

2.2.4 背景色的优化

相同浓度的碳酸氢钠与碳酸钠分别与显色试剂反应，结果如表5所示。

表5 背景色的优化Table 5 The optimization of background color

碳酸氢钠作为碱性试剂背景色明显较浅，与显色试剂显色效果最佳。因此，后续所有试验都以2.5 g/50 mL碳酸氢钠作为碱性试剂。

2.2.5 待测液的比例

HA 与碳酸氢钠以不同体积比 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4混合，显色效果如图1所示。

图1 待测液的比例Fig.1 The proportion of the solution

当HA与碳酸氢钠体积比为1∶1时扩散最小、显色最均匀，与待测溶液反应后显色效果最佳。因此，后续所有试验都以HA与碳酸氢钠体积比为1∶1作为待测液比例。

2.3 试纸的修饰

2.3.1 成膜物质修饰

将滤纸浸泡聚乙烯醇后与未浸泡聚乙烯醇滤纸对比，结果如表6所示。

表6 聚乙烯醇对渗透性的影响Table 6 The effect of polyvinyl alcohol（PVA）on the permeation of paper

浸泡过聚乙烯醇的滤纸渗透作用减小，因此舍弃该方案，进一步探究修饰试纸的方案。

2.3.2 聚离子溶液修饰

103慢速滤纸用聚离子水溶液和氨水处理过后与未修饰过的滤纸相比，分别滴加过HA与显色试剂的混合溶液后显色结果如图2、图3所示。

图2 聚离子溶液修饰的滤纸Fig.2 Modification of filter paper with poly（ionic liquids）solution

图3 未修饰的滤纸Fig.3 Unmodified filter paper

聚离子溶液修饰过的滤纸显色均匀、无背景色，不干扰测定液在试纸上的显色并且对测定液进行了富集，经过修饰的滤纸可以检测出0.1 mg/L的HA而未加修饰的滤纸则检测不出0.1 mg/L的HA。因此，利用此方法修饰后的滤纸不仅加深了测定液在试纸上的显色程度、提高了灵敏度、降低了方法的检出限，而且更易于观察、辨别色阶的变化，制作标准比色卡。

2.4 标准比色卡的制作

可视化HA检测试纸的标准比色卡如图4所示。

随着HA浓度的降低，在试纸上的显色情况随之变浅。当HA的浓度为0.1 mg/L时显色情况与背景色有明显的色阶变化，因此，该试纸法的检测限为0.1 mg/L。

图4 标准比色卡Fig.4 Standard color card

2.5 实际样品的检测

采用本研究建立的快速检测试纸法分别对提取过的样品1和样品2进行检测，检测结果如图5所示。

图5 实际样检测Fig.5 The detection of histamine in fish

样品1的显色情况比样品2的颜色要深，与比色卡对比和浓度为100 mg/L的组胺标准样品相似。所以，正常冷冻状态下储存的鱼中不含（或含有及其微量）HA，可安全食用；而变质的鱼中HA含量增加，如果摄入量超过100 mg会导致食物中毒。因此，本研究建立的快速检测试纸在现场的实际样检测中有很大的应用前景。

3 结论

本研究选用聚离子溶液修饰过的103型号慢速滤纸为载体，显色试剂为体积比3∶2的2.5 mg/mL对硝基苯胺与亚硝酸钠（对硝基苯胺溶剂为乙醇与2 mol/L盐酸的混合溶液体积比为9∶1，5 mg/mL亚硝酸钠溶剂为水和乙醇混合溶液体积比为1∶2），待测溶液为比例1∶1的2.5 g/50 mL碳酸氢钠与HA混合溶液，建立了可视化HA快速检测试纸法。试验结果表明：该方法的最低检测限为0.1 mg/L，实际样品检测可明显观察到变质样品中HA与显色试剂反应后的颜色变化。聚离子溶液修饰过的试纸降低了方法的检出限并且制作出的标准比色卡可长期保存。此试纸制造成本低、方法简单、便于储存且携带方便，能够快速、灵敏的定性及半定量的检测鱼类产品中HA，可批量生产并进行现场检测。