红景天苷提取工艺优化及对FADS1基因表达的影响

罗毅皓，万玉慧，孙万成

（青海大学农牧学院，青海西宁810016）

随着国民生活水平的日益提高，人们的饮食结构 发生了巨大改变，高脂类食物的摄入比例逐步增加，随之而来的人体脂肪代谢问题引起了广泛的关注。各种降脂类食品的研发及需求日益增长，更多能改善人体脂肪代谢速率的新产品应运而生。红景天一直被认为是抗缺氧、抗疲劳以及抗衰老等作用的佳品[1]，王树海通过研究红景天苷对脂肪细胞糖代谢的作用机理及影响，结果发现红景天苷可以增加脂肪细胞葡萄糖的摄取和利用[2]，王峥嵘通过研究红景天提取物对高脂饮食大鼠肝脏PPAR－α、PPAR－γ的影响，对小鼠的血生化指标进行测定，研究表明红景天提取物有效地降低了小鼠血液中的甘油三酯、高胆固醇、高游离脂肪酸含量，证明红景天提取物可有效改善脂肪代谢[3]。然而鲜有关于红景天苷在细胞层面对脂肪代谢影响的研究，本试验则设计通过使用组织细胞培养，定量加入红景天苷的方式，从分子水平探讨红景天苷作用细胞脂肪代谢后的结果，即通过测定与细胞脂肪代谢有关酶的基因（fatty acid desaturase 1，FADS1）表达量来进一步探讨红景天苷对细胞脂肪代谢的影响。

本试验通过研究红景天苷的提取温度、时间、料液比等几个因素对提取率的影响，在单因素试验的基础上，利用Box－Behnken中心组合试验设计对红景天苷的提取工艺进行优化，得出水提法提取红景天苷最佳提取工艺条件，最终建立一个高效、节能、无毒、无污染、操作简便、生产经济的红景天苷的提取方法[4]。随后进行HepG2肝癌细胞培养，待细胞生长至对数生长期，即细胞密铺于培养瓶底80%～90%左右时，通过添加不同浓度的红景天苷至组织细胞中，继续培养24 h后进行提取总RNA的提取，随即在逆转录聚合酶的作用下生成cDNA，以逆转录产物为模板，利用实时定量荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测组织细胞中FADS1基因mRNA的表达水平，分析FADS1基因在不同浓度红景天苷培养下的相对表达量差异，探究红景天苷对细胞脂肪代谢的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

红景天样品：青海可可西里食品有限公司，用KC－130小型粉碎机将其粉碎后，贮存于4℃冰箱内备用；红景天苷标准品：北京世纪奥科生物技术有限公司；HepG2肝癌细胞：上海生物科技有限公司。

1.2 试剂与仪器设备

TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒（提取 RNA）、TaKaRa PrimeScriptRRT reagent Kit试剂盒（反转录）、SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ：宝生物工程（大连）有限公司；DEME（高糖）培养基、双抗、DPBS、胎牛血清FBS、胰蛋白酶细胞消化液：生工生物工程（上海）股份有限公司。

PCR仪（ABI 97000）：上海迭戈生物科技有限公司；荧光定量 PCR（CFX96 TouchTM）：BIO－RAD 公司；Leica荧光倒置显微镜（DMI4000B）：北京万泰恒通国际科贸有限公司；CO2培养箱（IL161CT）：施都凯仪器设备（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 红景天苷提取与检测

将干燥的红景天根样品置于粉碎机中粉碎，准确称取1.000 0 g红景天粉末置于锥形瓶中，以蒸馏水为溶媒，在时间 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h、温度 40、50、60、70、80℃等试验条件下进行提取操作，随后进行真空抽滤，收集滤液。将滤液在沸水中加热2 min～3 min，随后置于冰箱冷却，经0.22 μm滤菌膜过滤，滤液全部转移至100 mL容量瓶中定容[4]。吸取1 mL提取液于100 mL容量瓶中再次定容，并于紫外分光光度计下波长为275 nm进行吸光值A的检测（m2=0.087 2A+0.129 2），红景天苷的浓度在 20 μg/mL～120 μg/mL 与吸光度呈线性相关，按公式计算红景天苷得率：

式中：E为红景天苷得率，%；m为称取样品的质量，mg；m2为提取液中红景天苷的浓度，mg/mL。

1.3.2 HepG2肝癌细胞培养

HepG2肝癌细胞培养方法参考文献[5]。

1.3.3 HepG2肝癌细胞总RNA的提取、PCR及荧光定量PCR

HepG2肝癌细胞总RNA的提取、PCR及荧光定量PCR方法参考文献[5]。

2 结果与分析

2.1 响应面法优化红景天提取工艺

在已知单因素的试验结果基础上，设定A（提取温度）、B（提取时间）、C（料液比），以 Z1=（A－50）/10，Z2=（B－1.5）/0.5，Z3=（C－20）/10 为自变量，红景天苷得率为响应值（Y），利用响应面法进行三因素三水平Box－Benhnken中心组合试验设计，试验因素及其水平如表1。

表1 因素水平设计表Table 1 Table of factors and levels for design

响应面分析试验共有17个试验，中心试验用来估计误差。17组响应面试验结果见表2。

表2 响应面试验分析Table 2 Analysis of response surface

响应面分析如图1～3所示，图1是提取温度（A）和提取时间（B）对提取率影响，图2是提取温度（A）和料液比（C）对提取率影响，图3是提取时间（B）和料液比（C）对提取率影响。

图1 提取温度（A）和提取时间（B）对提取率影响Fig.1 Temperature（A）and extraction time（B）influence on extraction rate

图2 提取温度（A）和料液比（C）对提取率影响Fig.2 Effect of temperature（A）and material liquid ratio（C）on extraction rate

图3 提取时间（B）和料液比（C）对提取率影响Fig.3 Effect of time（B）and liquid ratio（C）on extraction rate

在一个因素已经确定的情况下，另外两个因素的变化趋势呈现出先增大后减小的变化，从响应面最高点及其对应的等值线内可以看出，在所选区域范围内存在着极值，既是响应面上的最高点，也是等值线内最小椭圆内的点。图1可以看出随着A、B数值的减小，响应值Y大幅度减小，说明短时、低温不利于红景天苷的提取，图3直观表明料液比的加大及提取时间的加长，红景天苷部分水解，会导致小幅度区间内红景天苷的得率的降低[6-8]。

响应面方差分析见表3。

表3 响应面方差分析表Table 3 Response surface variance analysis

由此可知，一次项B是高度显著的，二次项A2、B2、C2也是高度显著的，所选因素对响应值的关系非简单线性关系。经二次回归拟合，得到回归方程：Y=1.82+0.056×A+0.22×B+0.099×C+0.015×A×B-2.500×10-3×A×C+5.000×10-3×B×C-0.49×A2-0.26×B2-0.23×C2

从上表数据中可以得出，各因素对红景天苷提取率的影响次序依次为：B>C>A，即提取时间>料液比>提取温度。可信度分析见表4。

表4 可信度分析表Table Reliability analysis

由表4可知，该回归模型也是高度显著的。判定系数R2=0.982 6，可以表明红景天苷提取率有98.26%来源于所选变量，使用上述回归方程来模拟，三因素三水平的试验是切实可行的。由Design-expert8.0.6处理以上数据，得到最佳提取温度为50.64℃、提取时间 1.71 h、料液比 1 ∶22.22（g/mL），理论最佳提取率为1.89%。为了检验响应面法的可行性，试验条件修正为红景天苷提取温度为50.6℃、提取时间1.7 h、料液比 1∶22.2（g/mL），进行红景天苷提取的验证试验，3次平行试验得到的平均提取率为1.85%，与理论值相差0.04%。因此，响应面法对红景天苷提取条件的优化是可行的。

2.2 红景苷对HepG2肝癌细胞FADS1基因表达影响

2.2.1 HepG2肝癌细胞FADS1基因扩增电泳

图4为肝癌细胞提取的RNA，经反转录及PCR扩增后得到FADS1的DNA电泳跑胶图。利用在编码区两侧设计的FADS1基因通用引物扩增目的DNA，获得约120 bp的DNA片段。

图4 FADS1基因电泳图Fig.4 FADS1 gene electrophoresis diagram

从图4中可以看出反转录得到的确为实验所需的FADS1目的基因，无引物二聚体及非特异性扩增产物的存在，且样品扩增条件的退火温度48.9℃适宜，可将反转录得到的cDNA用于后续实时荧光PCR试验[9-12]。

2.2.2 红景苷对HepG2肝癌细胞中FADS1基因表达影响

红景苷对HepG2肝癌细胞中FADS1基因表达影响如图5所示，随着红景天苷浓度增加，FADS1基因表达量增加。

脂肪酸去饱和酶1（FADS1）基因作为人体内n-3及n-6系列脂肪酸转化的限速酶基因，其表达量决定细胞合成不饱和脂肪酸能力的高低。如图5可知，红景天苷可以有效提高FADS1基因表达量，诱导机体产生更多脂肪酸去饱和酶，从而调节与载体结合的饱和脂肪酸或单不饱和脂肪酸在酰基链上形成更多双键，最终使脂肪酸不饱和程度提高，而起到降低血脂的作用[13-17]。

图5 不同红景天苷浓度组FADS1基因相对表达量Fig.5 Relative expression of FADS1 gene in the different concentration of rhododendrons

3 结论

1）红景天苷响应面法优化提取工艺，提取最佳工艺为提取温度 50.6℃、时间 1.7 h、液料比 1∶22.2（g/mL）。

2）各因素对红景天苷提取率的影响次序依次为：提取时间>料液比>提取温度。

3）红景天苷提取过程中为防止红景天苷水解，应避免长时间、高料液比处理。

4）红景天苷可刺激与脂肪代谢有关的FADS1基因表达量的增加，促进脂肪酸去饱和酶的合成，影响人体脂肪代谢过程，使机体内饱和脂肪酸及单不饱和脂肪酸含量降低，多不饱和脂肪酸含量增加。